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科研学霸天团,48小时有问必答
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问
PEI转染293T细胞和293S细胞,转染效率差异大吗?有了解293S大规模转染条件的吗?
灵枢天问
293T 和293S转染效率差异不大,都属于相对好转染的细胞,转染条件就是看你用的转染试剂了,根据你的试剂说明书来
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问
想问一下,在wb时,配制5%的脱脂奶粉,有的用pbst稀释有的人用tbst稀释,两个缓冲液有什么区别吗?
bamboopiggy
都是缓冲液,问题不大,我 喜欢用pbst,因为不需要调ph值,tbst是需要调ph值得,但是有人说tbst对磷酸化得蛋白好。
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问
请问pcrtargeting的bt340是什么的原理
汤姆卜丽波
BT340是一种温敏型质粒,在42℃高温诱导下质粒 BT340 可以表达 FLP 重组酶,FLP 重组酶可以识别质粒中安普抗性框两侧的 FRT 序列,将 FRT 之间的抗性基因敲除,在此过程中质粒 BT340 消失,之后原基因插入抗性基因的部分仅剩下 81bp 的 scar 序列 FRT 序列经 FLP酶切除后剩余的部分序列),所得即为原基因内部被敲除的重组质粒 。
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问
基因测序结果有两个碱基突变,还可以用吗
府宅
如果是表达的话,只要氨基酸序列没有改变,接下来的实验还是可以继续的,如果在其他区域,如果此位点不是你的核心区域,个人认为影响不大。
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问
小鼠造模打完肿瘤细胞后量瘤子忽大忽小,什么原因?
汤姆卜丽波
可能是种的时候引发了炎症,一直在炎症反应,不断的反复吸收
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问
wb实验,应什么软件可以分析不同蛋白的表达情况?
balalaLy
一般用imageJ软件,直接网络搜索,有非安装版,非常好用
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问
wb实验过程,想分析蛋白蛋白的表达情况,上样体积是否一致?
balalaLy
上样体积要求尽量一致,是为了保证每个孔在跑的过程中压力一致。不然隔壁孔的蛋白会往旁边体积少的地方歪。
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问
流式分析细胞凋亡实验中如果消化贴壁细胞前用PBS清洗,那不是把凋亡细胞都洗掉了吗
我不是药神88
流式处理细胞的时候,pbs要轻柔冲洗细胞1次,目的是为了去掉培养液(含血清的),以防止血清终止胰脢的消化;这之前倾倒培养液之后,用pbs处理1次细胞,并不会对起产生特别大影响,注意不要用枪头直接吹打细胞,这样基本上不会影响实验结果。过度吹打细胞会造成细胞机械性死亡。
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问
质粒转染,PEI的用量与细胞数有关,还是与质粒数有关?PEI的量不能超过多少?
bamboopiggy
和质粒的量有关,和细胞的数目也有关,一般细胞融合度到50%-60%开始做转染,按照不同的比例如1:2-1:8的比例来配转染试剂。
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问
质粒转染中,在不对细胞活率影响下,平均单个细胞能承受多少拷贝质粒,或多少质量的质粒?
汤姆卜丽波
一般单个细胞根据质粒的大小来看,转染效率比较好的话可以接受2-3个,差不多的话基本一对一
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问
质粒导入载体失败咋办?
天一湖医者
排查问题的话,先查酶有没有问题(连接酶连别的片段和载体试试看,还有酶切产物纯化后直接转化看长多少菌落来判断酶切是否成功),然后插入片段可以用TA克隆去测序看是不是PCR成功。
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问
求助:蛋白重组表达
bamboopiggy
先确定你蛋白表达载体确实构建成功,然后再重新挑个菌试试,可以加大一下菌液的量
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问
PCR混检电泳阴性正常无条带,但单检电泳阴性出现和阳性相同位置的条带,向高手请教?
汤姆卜丽波
混检的时候模板量混在一起每个都不高,通过扩增,假阴性结果很容易出现的。
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问
大体系PEI转染293S细胞,细胞1.undefined10^6/ml,质粒与PEI比例为1:4,第二天细胞过滤下降,是什么原因呢?有做过的吗
bamboopiggy
293S细胞是被驯化成能够悬浮培养且能够耐受低钙离子培养条件的293细胞系。你可以靠过梯度做质粒与pei的浓度比例:从1:2到1:8
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问
户外核酸检测时,室外温度较高,是否需要给试剂降温存放,最长存放多长时间不会影响检测结果?
汤姆卜丽波
最好低温存放,一般24小时之内不影响检测结果
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问
将目的基因通过BP反应构到中间载体中,菌P检测电泳条带大小正确,但是提质粒后跑电泳,质粒的条带大小不对,请问为什么啊?
汤姆卜丽波
可能菌液pcr.出现了假阳性,提质粒出来是空载体
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问
药品稳定性过程杂质超标,处方如何调整
天一湖医者
药品稳定性过程杂质超标,最好进行质控。如目前不做,则需进行研究,给出解释。并做好进行质控准备。处方可以根据情况进行同类药物调整。
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问
咽拭子试剂撒出,是不是整换都要重新采集?
未来9
不一定,要看洒落后剩余试剂的量够不够PCR检测的要求
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问
咽拭子采集以后要在多长时间之内检测?对温度有什么要求吗?
天一湖医者
在24小时内检测的话,4度保存就可以了,24小时外采集,0度保存。
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问
小鼠小肠固有层淋巴细胞提取细胞量都很少,综合了很多文献中的方法,细胞量依然达不到?求大家的建议。
秋秋欣欣
消化液要用不含钙离子的,均匀缓慢加入
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