问提出来的Rna浓度只有200ng/ul,略有降解,反转录出来的cDna作为模板,然后去跑pcr,是不是跑出来的条带都很浅呀
Eason老歌迷
有点浅。引物、模板没问题的话,就加cycle,多扩几轮,就亮了.(一般pcr酶和buffer是没有问题的,除非你反复冻融或者长时间放置室温)如果上一轮扩出来特异性好的话,可以适当降低退火温度.多扩了几轮,退火温度也降低了,但是条带仍然很淡,这时候,基本上就是引物和模板的问题了.你要好好看看引物特异性好不好,dimer亮不亮,(自身发夹一般不会有太大影响);模板的话,要看看GC含量高不高,模板质量好4 回答2344 围观
问为什么二次pcr出来的条带还是这么浅,是胶的问题吗
Eason老歌迷
我之前也遇到过这类情况。引物、模板没问题的话,就加cycle,多扩几轮,就亮了(一般pcr酶和buffer是没有问题的,除非你反复冻融或者长时间放置室温)如果上一轮扩出来特异性好的话,可以适当降低退火温度.多扩了几轮,退火温度也降低了,但是条带仍然很淡,这时候,基本上就是引物和模板的问题了.你要好好看看引物特异性好不好,dimer亮不亮,(自身发夹一般不会有太大影响);模板的话,要看看GC含量高不5 回答2130 围观
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