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多元PCR(多重PCR，Multiplex PCR，MPCR) 是指在一个 PCR 反应中使用一个模板和几对引物同时扩增多个目的片段的 PCR 反应。这项技术非常有用，他不仅可以提高 PCR 的产率还能提高?DNA?样品的利用率。另一种形式的 MPCR 是组合 PCR, 组合 PCR 是在同一 PCR 反应中使用几个不同的模板和几对引物。多元 PCR 和组合 PCR 往往被当作同义词使用。设计策略MPCR 要求所有的引物对在同一条件下扩增其各自的特异序列。大多数多元 PCR 反应 局限于扩增 5~10 个目的片段，原因之一是反应中，每另加入一对引物会导致一定程度的灵活性的丢失。引物数量的增加也使引物二聚体和非特异扩增出现的概率增加。因此，进行多元 PCR 要求周密计划，且需多次尝试，使反应条件优化。理论上，一个多元反应中，所有引物扩增其特异序列的效率应该是一样的，但通常是很难预测一对引物的效率。在相似条件下，退火温度几乎相同的寡核苷酸可更好地工作。多元 PCR 引物设计和优化的一般规律当设计 MPCR 引物时，除了引物设计的一般规律外，其他一些因素也必须考虑。一般 来说，一个多元反应中

开始之前：其实非常简单，不需要你下载任何软件，但是你得有一台电脑能上网。当然，最重要的是，你要很清楚用于做引物的模板序列，至于怎么找模板序列，不再本次讨论范围。另外，要先对PCR目的序列的长度有个大致估计，好了，马上开始吧：第一步：找到Primer3的站点。 你不用记住这个站点，但是要记住“Primer3”这个词，然后打开GOOGLE首页，输入Primer3，跳出来的第一个项目就是了“Primer3 Input 0.4.0 ” 。第二步：贴上模板序列。 进入Primer3站点，可以看到一个引物设计的界面。（如下图）在“Paste source sequence below (5'->3'…”下面的大空框里面把你的模板序列粘帖进去。注意是5'->3'方向的，数字或者空格都没关系，软件会自动过滤的。第三步：重要参数设定。 首先是“ Product Size Ranges ”，如果你不希望软件给你随便做的话，首先要调整的就是这个参数。默认的参数实际上是从100到1000，这个你得自己改，如果你希望产物的大小符合你的预期，尽可能把范围改小，比如480-500，具体看情况调整。第二个

在体外将两个或多个来源相同或不相同的 DNA 片段连接成新的重组 DNA 分子，再转到特定宿主细胞中进行自主复制并表达。这是分子生物学中的基本技术。DNA 重组技术的基本程序包括：（1）获得外源 DNA：外源 DNA 是进行 DNA 重组的目的 DNA 片段，一般采用 DNA 聚合酶链式反应 (PCR) 或逆转录-DNA 聚合酶链式反应 (RT-PCR)、基因组文库或 cDNA 文库筛选等方法获得。（2）载体的构建或选择：分子生物学中用的载体是指能在特定宿主细胞中自主复制的 DNA 分子，例如细菌的质粒、噬菌体、病毒等，常用的载体一般为质粒；根据需要可直接从公司购买合适的载体，也可以自己构建。（3）连接：目的 DNA 片段和适当载体的连接, 一般采用核酸内切酶分别消化 DNA 片段和载体，使它们的末端能够连接到一起构成重组 DNA 分子。由于所用内切酶的切割特点不同，产生三种连接方式：粘端连接、平端连接和不相配的连接。（4）转化：将连接的重组 DNA 产物导入合适的宿主细胞，使其在宿主细胞内复制扩增或表达，赋予宿主细胞新的生物特征。（5）克隆化：重组 DNA 分子转化大肠杆菌后，在平板

一、热启动 PCR热启动 PCR 是除了好的引物设计之外，提高 PCR 特异性最重要的方法之一。尽管 Taq DNA 聚合酶的最佳延伸温度在 72℃，聚合酶在室温仍然有活性。因此，在进行 PCR 反应配制过程中，以及在热循环刚开始，保温温度低于退火温度时会产生非特异性的产物。这些非特异性产物一旦形成，就会被有效扩增。在用于引物设计的位点因为遗传元件的定位而受限时，如 site-directed 突变、表达克隆或用于 DNA 工程的遗传元件的构建和操作，热启动 PCR 尤为有效。 限制 Taq DNA 聚合酶活性的常用方法是在冰上配制 PCR 反应液，并将其置于预热的 PCR 仪。这种方法简单便宜，但并不能完成抑制酶的活性，因此并不能完全消除非特异性产物的扩增。 热启动通过抑制一种基本成分延迟 DNA 合成，直到 PCR 仪达到变性温度。包括延缓加入Taq DNA 聚合酶在内的大部分手工热启动方法十分烦琐，尤其是对高通量应用。其他的热启动方法使用蜡防护层将一种基本成分，如镁离子或酶，包裹起来，或者将反应成分，如模板和缓冲液，物理地隔离开。在热循环时，因蜡熔化而把各种成分释放出来并混合在一

DNA 序列的改变称为突变, 这将导致相关蛋白质的序列变化。 DNA 上特定核苷的取代技术称作基因定位突变法 (site directed mutagenesis)。 通过病酶动物将突变的基因导入微生物体内即可产生非天然蛋白. 这种方法在研究蛋白质中特定氨基酸的功能上极为有价值。与定位突变不同, 在 PCR 中增加 Mg2 离子可产生随机点突变; 高盐度降低了 DNA 聚合酶的再现精度。突变频率可由离子浓度控制。这种方法称作"易错 PCR"。将突变基因重组在加速产生多样性方面较定位突变效率更高。这种方法称作 DNA 改组技术 (shuffling)。

实验原理核酸分子杂交是通过配对碱基对之间的非共价键（主要是氢键）结合，从而形成稳定的双链区。杂交分子的形成并不要求两条单链的碱基顺序完全互补，所以不同来源的核酸单链只要彼此之间有一定程度的互补顺序（即某种程度的同源性）就可以形成杂交双链。分子杂交可在 DNA 与 DNA、RNA 与 RNA 或 RNA 与 DNA 的二条单链之间进行。由于 DNA 一般都以双链形式存在，因此在进行分子杂交时，应先将双链 DNA 分子解聚成为单链，这一过程称为变性，一般通过加热或提高 pH 值来实现。用分子杂交进行定性或定量分析的最有效方法是将一种核酸单链用同位素或非同位素标记成为探针，再与另一种核酸单链进行分子杂交。随着基因工程研究技术的迅猛发展，新的核酸分子杂交类型和方法在不断涌现和完善。核酸分子杂交可按作用环境大致分为固相杂交和液相杂交两种类型：一、固相杂交将参加反应的一条核酸链先固定在固体支持物上，一条反应核酸游离在溶液中。固体支持物有硝酸纤维素滤膜、尼龙膜、乳胶颗粒、磁珠和微孔板等。由于固相杂交后，未杂交的游离片段可容易地漂洗除去，膜上留下的杂交物容易检测和能防止靶 DNA 自我复性等优点，所以

随着分子生物学技术的发展，检测基因结构和突变的方法不断涌现。尤其是 PCR 技术问世以后，各种与 PCR 相结合的基因检测技术进一步推动了基因研究的发展。如不对称 PCR 产物的直接测序 、核糖核酸酶酶切法 (Ribonuclease cleavage，RNAase)、限制性片段长度多态性分析 (Restriction Fragment Length Polymorphism，RFLP) 等等已成为基因分析的有力工具。但这些方法操作比较繁琐，局限性较大，或要求实验条件高，不适合一般临床实验室使用。1989 年问世的 PCR-SSCP(下文称 SSCP) 作为检测基因突变的方法，经不断地改进和完善，更为简便、快速、灵敏，不但用于检测基因点突变和短序列的缺失和插入，而且还被用于 DNA 定量分析，监测 PCR 诊断实验中的交叉污染情况，以及传染源的调查等。由于 SSCP 的突出的优点，近几年被大量地应用。一、SSCP 的原理及特点日本 Orita 等研究发现，单链 DNA 片段呈复杂的空间折叠构象，这种立体结构主要是由 其内部碱基配对等分子内相互作用力来维持的，当有一个碱基发生改变时，会或

Southern 杂交是分子生物学的经典实验方法。其基本原理是将待检测的 DNA 样品固定在固相载体上，与标记的核酸探针进行杂交，在与探针有同源序列的固相 DNA 的位置上显示出杂交信号。通过 Southern 杂交可以判断被检测的 DNA 样品中是否有与探针同源的片段以及该片段的长度。该项技术广泛被应用在遗传病检测、DNA 指纹分析和 PCR 产物判断等研究中。但由于该技术的操作比较烦琐、费时，所以现在有一些其他的方法可以代替 Southern 杂交。但该技术也有它的独特之处，是目前其他方法所不能替代的，如限制性酶切片段的多态性 (RFLP) 的检测等。一、基因组 DNA 的制备（前述）二、基因组 DNA 的限制酶切根据实验目的决定酶切 DNA 的量。一般 Southern 杂交每一个电泳通道需要 10-30 μg 的 DNA。购买的限制性内切酶都附有相对应的 10 倍浓度缓冲液，并可从该公司的产品目录上查到最佳消化温度。为保证消化完全，一般用 2-4 U 的酶消化 1 μg 的 DNA。消化的 DNA 浓度不宜太高，以 0.5 μg/μl 为好。由于内切酶是保存在 50% 甘油内的

第一个用于研究细胞骨架的药物，它是真菌分泌的生物碱。细胞松弛素(细胞松弛素 B 及其衍生物)在细胞内同微丝的正端结合, 并引起F-肌动蛋白解聚，阻断亚基的进一步聚合。当将细胞松弛素加入到活细胞后，肌动蛋白纤维骨架消失，使动物细胞的各种活动瘫痪, 包括细胞的移动、吞噬作用、胞质分裂等。它对微管没有作用, 也不抑制肌收缩, 因肌纤维中肌动蛋白丝是稳定的结构, 不发生组装及解聚的动态平衡。

流式细胞术（Flow Cytometry，FCM）是一种对液流中排成单列的细胞或其它生物微粒（如微球，细菌，小型模式生物等）逐个进行快速定量分析和分选的技术。 作为应用流式细胞术进行检测的技术平台，现代流式细胞仪产生于上世纪六七十年代。经过近四十年的发展和完善，今天的流式细胞仪已经十分成熟，并被广泛的运用于从基础研究到临床实践的各个方面，涵盖了细胞生物学、免疫学、血液学、肿瘤学、药理学、遗传学及临床检验等领域，在各学科中发挥着重要的作用。 流式细胞术-概述一种在液流系统中，快速测定单个细胞或细胞器的生物学性质，并把特定的细胞或细胞器从群体中加以分类收集的技术。其特点是通过快速测定库尔特电阻、荧光、光散射和光吸收来定量测定细胞 DNA 含量、细胞体积、蛋白质含量、酶活性、细胞膜受体和表面抗原等许多重要参数。 根据这些参数将不同性质的细胞分开，以获得供生物学和医学研究用的纯细胞群体。目前最高分选速度已达到每秒钟 3 万个细胞。 现代流式细胞术综合了流体力学技术、激光技术、电子物理技术、光电测量技术、计算机技术、荧光化学技术及单克隆抗体技术，是多学科多领域技术进步的结晶。随着现代科技的高速发

组成和普通显微镜一样，只不过物镜与照明系统颠倒，前者在载物台之下，后者在载物台之上，用于观察培养的活细胞，具有相差物镜。莱卡倒置显微镜进入 20 世纪 80 年代以来，光学显微镜的设计和制作又有了很大的发展，其发展趋势主要表现在，注重实用性和多功能方面的改进。在装配设计上趋于采用组合方式，集普通光镜加相差、荧光、暗视野、DIC、摄影装置于一体，从而操作灵活，使用方便。

细胞培养品名：细胞培养拼音：xi bao pei yang英文名称：culture of cells说明：包括微生物细胞、植物细胞和动物细胞培养。将动植物组织或细胞从机体取出，分散成单个细胞或直接以单细胞生物，使其在含有必要生长条件的培养基或培养瓶中继续生长与增殖。细胞培养是细胞生物学研究方面十分重要的技术。细胞周期及其调控、癌变机理、衰老、基因表达与调控等重要进展都离不开细胞培养技术。植物细胞培养为植物育种开辟了一条崭新的途径。大规模的细胞培养为营养品、疫苗生产以及药物研究、开发与肿瘤防治提供了全新的手段。原核生物、病毒培养为基因工程等现代生物工程提供了必要条件。细胞培养的基础知识细胞培养（cell culture）细胞培养的含义，简单地说即是把来自机体的组织经分散成为单个细胞，放在类似于体内的体外环境中生存，使其不断生长、繁殖或传代，借以观察细胞的生长、繁殖、衰老等生命现象。还可以利用细胞进行细胞工程与细胞癌变等重大问题的研究。细胞培养也是研究病毒与研制疫苗的基础技术。因此细胞培养技术在遗传学、免疫学、肿瘤学、病毒学、分子生物学等领域已得到广泛的应用。下面介绍原代培养和传代培养的基

-基于阻抗方法实时、无标记、长期监测细胞表型- Maestro Z基于阻抗检测的细胞分析技术，使得实时、不间断且无需标记的细胞监测成为可能。对数据流的后续分析可以揭示细胞间互作和细胞-药物反应的动力学，可以更好地理解其机理而无需做费时费力的多次终点法实验。（可用于细胞增殖、肿瘤免疫、细胞毒性及活力检测、药物筛选、信号通路(GPCR/CFTR)、细胞间相互作用 (屏障功能)、病毒学研究及细胞迁移等细胞表型研究。） 细胞表型是涉及基因和蛋 ...

RT-PCR 和 qPCR 是大多数实验汪在科研道路上需要做的实验，大家看到这儿一定不以为意，这不就是两个简单的小实验，看两次 protocol，后面都不需要操作指南也能记住步骤的。可是…记住了实验步骤就真的等于能做好实验？能得到想要的数据、漂亮的曲线吗？ 看似简单的实验，实则暗流汹涌，稍不注意的地方就可能有旋涡把实验前进的小船打翻，要不怎么会有那么多人为此悲催的实验结果整日愁眉苦脸，屡战屡败，屡败屡战……最后还是得战战战！ 其实，多注意点小细节就可能帮助实验汪们减轻这样的苦恼，少做一些不必要的重复劳动，从而一战成功（即使不是一战，也少了 n 战）。 RT-PCR 虽然只是逆转 RNA，但却是决定后续 qPCR 或其他实验成功的关键因素，是重中之重。以下几点 tips 请查收： 1. 提取好的 RNA，先检测质量对 RNA 质量的检测包含 RNA 完整度测定及 RNA 产量测定两部分：（1）RNA 的完整度对 cDNA 的合成结果会产生重要的影响。通过琼脂糖凝胶电泳进行检测是方法之一，这也是一般实验室最常用的方法。通常完整的真核 RNA 应包括 28S、18S 及 5S RNA 条带

PCR(Polymerase Chain Reaction) 即聚合酶链式反应，对于常年狂奔在实验室的实验狗来说并不陌生。那么，对于 PCR 反应的核心成份，DNA 聚合酶，你选对了吗？ 常见的 DNA 聚合酶如 Taq、Phanta、Pfu、KOD、Primerstar、Klenow、Bst、Phi29 等等。根据耐热性来分可分为耐热酶和常温酶。耐热聚合酶如 Taq、Pfu、KOD、Primerstar 等，常温聚合酶包括 Klenow、Bst、Phi29 等。根据保真度来分，高保真聚合酶 Pfu、KOD、Phanta 等，普通聚合酶 Taq 等。 面对如此之多的选择，大多数刚进实验室的新生们默默表示，选择恐惧症，犯了…… 那么，解决的方法是，根据实验目的选择合适的 DNA 聚合酶。比如：常规的 PCR 扩增和菌液鉴定，长度小于 5kb 的片段，保真度要求不高，使用 Taq 酶扩增即可。选用 Mix 的形式，混样更加简单，操作更加便捷。如果混样泡沫多，想灭掉泡沫的话，推荐大家使用 Green Taq Mix。想要获得较高的产量，可以选择 Taq Plus DNA 聚合酶，相对于 Ta

样本想要成功转化成为 PCR 的结果，前期需要注意的步骤有很多，包括：样本的采集、运送、保存以及核酸提取，每一个步骤都需要小心翼翼，中间的过程可谓是困难重重。样本在转化成 PCR 结果的过程中，究竟是哪些因素导致转化过程如此艰难呢？下面由小编带着大家一起去扒一扒样本中影响 PCR 检测的抑制物。 图 1. 核酸处理与检测流程图 一、PCR 抑制物的来源PCR 抑制物的来源包括内源性与外源性两种1. 内源性天然存在标本中的组成成分。如：免疫球蛋白、蛋白酶、血红蛋白及其代谢产物、血红蛋白中的乳铁蛋白、肌红蛋白、脂类、黏蛋白、尿素、离子、胆盐、多糖等。 2. 外源性外部引入的抑制物。如：肝素抗凝剂、纤维素和硝酸纤维素、手套滑石粉、标本容器或采样器材上含有的抑制物 二、PCR 抑制物一般作用机制PCR 抑制物中大部分的作用机制尚不完全清楚，但基本可以归为三类：1. 干扰核酸提取过程中的细胞裂解；2. 降解或包裹核酸；3. 热稳定 DNA 聚合酶失活。 1. 干扰核酸提取过程中的细胞裂解 细胞裂解，核酸释放使得核酸与酶作用产生扩增。如果细胞裂解不完全，核酸释放不完全，就不会产生扩增。常见的简单处

荧光定量 PCR 的常见异常结果除了扩增曲线异常、融解曲线异常两类常见情况外，qPCR 实验中通常还会遇到以下三大类情况： 1. 复孔间重复性差怎么办？复孔间重复性差一般会有以下两种情况：（1）CT 值很大，如 CT≥ 30，重复性差属于正常现象。该现象符合泊松分布，即在有效模板量很少的情况下，模板与引物的碰撞存在随机性，直接导致复孔间的 CT 值差异较大。解决方法：如果融解曲线没有杂峰，无模板阴性对照同目的基因的 △CT 值为 3 or 5 以上，那 CT 值为准确的，可多设置几个复孔，选择重复性好的 CT 值参与计算。（2）CT＜30，重复性较差。这种情况一般同操作有关。解决办法：从以下几个方面进行问题的排查：①加样准确度；②移液器吸取液体的准确度；③定期校准 qPCR 仪。 ①加样准确度避免小体积加样，减少加样误差。可以将引物、SYBR Green Mix、ddH2O 配置成混合体系，并且增加模板的稀释梯度，大体积加样。如：原液 cDNA 添加 1μl，可以更改为原液 cDNA 稀释 5 倍，添加 5μl，使用 ddH2O 补齐体系至 20μl 即可。SYBR Green Mi

实时荧光 PCR（real-time PCR）因其全封闭扩增，简单快速，重复性好，无扩增后处理以及易于自动化等优点，广受大家欢迎。在分子诊断领域中，实时荧光 PCR 方法涉及的领域包括感染性疾病、肿瘤、遗传病等多方面。那么实时荧光 PCR 技术是如诞生的呢？下面，由小编带领大家一起了解大牛们是如何经过精密的研究一步一步探索出来这项技术。1983 年1983 年美国科学家 Kary Mullis 发明 PCR 方法，用于放大扩增特定的 DNA 片段，可看作是生物体外的特殊 DNA 复制。1985 年1985 年，Cetus 公司从温泉中分离的嗜热菌（Thermus aquaticus）株中纯化出耐热 DNA 聚合酶（后面简称 Taq 酶）。该酶耐高温的性质极大地提高了 PCR 扩增的效率，使得 PCR 真正变为现实，为其自动化铺平了道路。但是 PCR 技术也有其相应的局限性，就是对扩增产物分析时需要开盖处理，容易造成污染。为了解决这一问题 Russ Higuchi 进行了一系列相关研究。1992 年1992 年，Higuchi 在一次报告中提出了实时荧光定量 PCR 技术。通过检测溴化乙

PCR 过程中免不了遇到各种问题，如扩不出目的条带、有非特异性条带、空白对照出现扩增产物、扩增产物跑胶弥散或拖尾、高保真 PCR 出现突变等等。今天师兄就带大家来聊一聊 PCR 的常见问题应该如何解决。 PCR 实验包括反应体系的配置和反应程序，反应体系中有模板、引物、dNTP、酶、buffer、Mg2+，反应程序又包括预变性、变性、退火、延伸和彻底延伸。那么在 PCR 出现问题时主要是从反应体系的各个组分和反应程序上来进行调节优化。 Q1: 实验组无扩增条带A1:(1) 引物检查人工合成的引物是否因存储条件不当而降解（建议用新合成的引物进行尝试）；引物设计是否合理，可利用BLAST检查引物特异性或重新设计引物（如果之前用过该引物，可排除引物设计问题）。 (2) 模板长期放置、反复冻融会导致模板断裂、开环或降解，应使用新鲜制备的 DNA 双链作为模板；模板 GC 含量过高会导致 DNA 的双链无法打开，此时加入 PCR Enhancer，可以有效降低解链温度；模板为粗品，有可能是 DNA 未释放出来（若样本为植物叶片，要确保植物为非多糖多酚植物，取新鲜幼嫩的叶片，并将叶片面积

在哺乳动物和昆虫细胞表达系统中，目的蛋白经常分泌到细胞培养基。因此，在进行纯化前，我们的目的蛋白已存在于大体积培养液中。然而有时，用来纯化目的蛋白柱子体积却只有 1 ml。时间金贵，手动一次一次的将样品加入柱子中就太麻烦了，简直是要加到头秃有木有！ 不知道大家为了简化操作，节省时间，都使用了怎样的方法来上样呢？ 今天为在这里为大家分享一个锦囊工具：Wet Fred。这个小体积的工具非常灵活，可以根据我们的实验需要，使用在实验台、冰箱和冷室中。 优点Wet Fred 工作原理是静水压力（虹吸原理），适配 IBA 的 Strep-Tactin® /XT 重力柱。将培养液瓶和液体收集瓶通过这个工具连接起来，拉动推塞，通过调节高度来调节流速，就能达到「自动」上样啦。 1. 操作简单2. 可以过夜，也可以放在冰箱中3. 不会堵塞4. 柱子不会变干燥5. 适合体积大的样品 这种不用在旁监督的上样小工具，简直是解放双手的利器！