血细胞计数原理你真的懂吗？

细胞培养技术中，细胞计数是一项基本功，对于标准化培养条件以及需要精确定量的实验来说都非常关键。这里介绍使用血细胞计数器对细胞进行计数的经典方法以及中间一些需要注意的细节。

制备细胞悬液：

对于贴壁生长的细胞，我们需要首先使用胰酶消化的方法使细胞从培养皿表面脱落

根据需要加入合适体积的培养基，将细胞进行中和及稀释，以得到均质的细胞悬液。要求尽可能将细胞吹打散开，不要残留任何细胞团

准备血细胞计数器：

使用70%乙醇将盖玻片和血细胞计数器清洁干净

将将盖玻片润湿（使用水或呼一口气，目的是使盖玻片与血细胞计数器接触更紧密，易于粘连），并覆盖至血细胞计数器上

台盼兰染色（可选）：

如果需要计算细胞的活力，则需要将细胞悬液和0.4%台盼兰等体积混合

室温孵育3-5分钟，使台盼兰完全进入死细胞，使死细胞着蓝色

血细胞计数器加样：

使用吸管将细胞悬液或细胞/台盼兰混合液滴加到血细胞计数器计数池的边缘。此时液滴将在虹吸的作用下进入盖玻片下方的计数池

以同样的方式在另一侧的计数池中也加入细胞悬液

将计数板放置几分钟使细胞完全扩散，同时用吸水纸吸除多余的液体

细胞计数：

在100倍显微镜下，移动计数板将视野对准计数板的中央大方块，该方块四周有一圈3条平行线包围，中间有密集的网格。中央方块区差不多刚好可以填满整个视野（右上图中标记的3号位置）

使用手持式计数器记录计数池四个角以及中央方块内的细胞数（1-5号位置，经典的current-protocol推荐每个方块细胞数应不大于20-50），并重复记录另一侧计数池中的细胞数，总计十个方块。计数的方法是只计算上边和左边压线的细胞，而右边和下边压线的细胞不予计算（下图，总体原则是“计上不计下，计左不计右”，判断标准为是否接触三条边线的中间线）。如果有多个细胞没有吹散成团存在，此时只可记为一个细胞。如果团块很多，则可能需要重新吹打甚至消化直至绝大多数细胞为单个细胞

血细胞计数器计数原则

计算细胞数：

血细胞计数器的机构示意图

由血细胞计数器的构造可以看出，血细胞计数器每个大方块可以容纳的体积为：

1 mm²×0.1 mm = 0.1 mm³ = 10^-4 cm3 = 10^-4 ml

也即每个大方块的体积为万分之一毫升，因此在计算每毫升液体中的细胞数时需要乘以10⁴。

在常规没有使用台盼兰染色时，可以以下面公式计算每毫升培养基中细胞的个数：

每毫升培养基中细胞的个数 = 每个方块内细胞的平均数 × 细胞稀释比例 × 10⁴

如何使用了台盼兰染色，还需要计算活细胞的比率：

活细胞比率 = 台盼兰拒染细胞数 / 总细胞数

此时细胞数的计算公式为：

每毫升培养基中活细胞的个数 = 每个方块内细胞的平均数 × 活细胞比率 × 细胞稀释比例 × 2 × 10⁴

注：乘2是由于在台盼兰染色时，进行了等体积混合，相当于稀释了一倍。