全部

一、大鼠灌胃 大鼠灌胃是最常见的给药方法之一。灌胃所用的针头可以从市场上购买，操作方法和小鼠灌胃大同小异，只是由于大鼠体积较大，抓大鼠的手法和小鼠有所不同。 大鼠灌胃是在清醒状态下进行的，不需要麻醉。大鼠的灌胃针长约6～8cm，直径约1.2mm。 大鼠灌胃时，右手持灌胃注射器，左手拇指和食中二指相对，抓住大鼠颈部皮肤，使大鼠的头部和颈部及躯干呈一直线，不需要固定大鼠的尾巴，就可以实施灌胃操作了，其余的操作均和小鼠一样。 大鼠一般灌胃量为1ml/100g体重，因此一般大鼠灌入2ml是可以的。大鼠的灌胃给药体积一般为5～10ml/kg。但是药物的浓度是需要自己按照动物实验方法学的方法进行换算：200g大鼠对应70kg人的折算系数为0.018。 二、大鼠腹腔注射 腹腔注射是常见的给药方式，尤其是在麻醉时。常见的麻醉方法均是麻醉药物腹腔注射。 大鼠腹腔注射的方法和小鼠基本相同。 1.大鼠腹腔注射可以用5ml的注射器，配合5.5～7号针头。 2.腹腔注射时右手持注射器，左手的小指和无名指抓住大鼠的尾巴，另外三个手指抓住大鼠的颈部，使大鼠的头部向下。这样腹腔中的器官就会自然倒向胸部，防止注射器刺入

一、SD大鼠的麻醉 1、SD大鼠腹腔麻醉 把异氟烷和脂肪乳混合做成乳化异氟烷，腹腔注射，3分钟麻醉，30分钟清醒。 乳化异氟烷制备：用30%的脂肪乳为载体，在室温下（20℃）应用玻璃瓶法，配制成8%的乳化异氟烷。即将1.2ml的液态异氟烷和21.3ml的30%脂肪乳加入至一个气密性良好的25～30ml玻璃容器内，在振荡器上以2000r/min的速度剧烈震荡30s，静置30s，然后再以2000r/min速度剧烈震荡50min，达到平衡后放置于4℃冰箱保存备用。 乳化异氟烷，大鼠腹腔注射的半数有效量（ED50）相当于液态异氟烷0.51～0.64ml/kg，半数致死量（LD50）相当于液态异氟烷1.10～1.46ml/kg，治疗指数（TI）为2.24。致死量大鼠表现为呼吸抑制、心律失常，继而心跳停止。病理解剖显示腹腔注射乳化异氟烷不会引起心、肺、肝、肠系膜的病理改变。 2、SD大鼠吸入麻醉 可以作一个小金鱼缸 （四方形） 算出体积，钻个眼用橡皮塞塞住，老鼠装进去封住缸口，从橡皮塞插上注射器给液态吸入麻醉药（如1ml异氟烷可挥发成196ml的气体），算出需要的浓度就会算出需要的液态麻醉药量，一

小鼠灌胃方法比较简单，需要关注的只有两点：一是要保持小鼠的头部和颈部成一直线，方便灌胃针头进入，二是动作要轻柔，从口角进入，防止损失食道。做的多了自然就熟练了。具体操作过程如下：1. 准备灌胃针头。一般可以从市场上面买到，实在没有的话，可以用12号的针头，剪去针尖，用砂纸将头端磨平，也可以用。但是买的灌胃针头的头端用锡或者适宜的方法处理了针头的锐口，自己用砂纸不可能将所有的锐口都磨掉，用这样的针头灌胃，损失小鼠食道的可能性比较大。2. 抓住小鼠，使其头、颈和身体呈一直线。抓小鼠的动作很简单，左手的小指和无名指抓住小鼠的尾巴，另外三个手指抓住小鼠的颈部即可。因为小鼠始终在活动中，若一次抓的感觉不是很顺手，要放开重新抓，不要逞强进行下一步操作。3. 抓好小鼠就可以灌胃了，一般用1 ml的注射器配灌胃针头。灌胃针头从小鼠的嘴角进入，压住舌头，抵住上颚，轻轻向内推进，进入食管后会有一个刺空感，进入食道后就可以推注药液了。（我认为，所谓的灌胃，不必要灌胃针头进入小鼠的胃部，进入食管后就可以推药了，这样对小鼠食道的损伤要小点，特别是要长期灌胃给药的情况下。）当然，灌胃针头也可以再往里面深入一点，防

灌注固定主要用于神经系统，其他组织意义不是很大，而且耗时耗力。对神经系统防止变性效果较好！一、小鼠灌注灌流固定小鼠时我一般采用输液器的针头(4 号半，这样肉眼可见就是肺部明显充气胀大变白，针头要从心轴方向进针，刺入心尖 3~4 毫米左右就可以了，开始灌流后剪破右心耳，约 40 毫升生理盐水，后再灌流约 20 毫升多聚甲醛，整个灌流固定的过程就完成了。二、大鼠灌注按大鼠体重，用 2% 戊巴比妥钠（0.25ml/100g）进行腹腔注射麻醉，开胸暴露心脏，向左心室内注射 1% 肝素钠 0.2ml 后经左心室行主动脉插管， 血管钳固定后剪开右心耳，先以生理盐水 150ml 快速冲洗血管，然后用4%多聚甲醛的 0.01mol/LPBS（4℃，PH7.40）250ml 灌注固定，先快后慢，共需时间为 50min，之后取材，置4%多聚甲醛固定液后固定，在 4℃ 冰箱内保存。多聚甲醛进入大鼠体内，大鼠会出现四肢、尾的抽搐，最终以肝脏发白、内脏鼓起即灌注好。三、脑组织免疫组化实验1. 灌注固定用的针头，一般都用注射针头。灌注大鼠一般可用10到12号针头，小鼠可用 6、7 号针头，但很重要的一点是要把针头

一、技术背景： Adeasy 系统利用了腺病毒具有的高感染能力，可高度浓缩等优点，并破坏了腺病毒基因组中的早期基因E1，使之成为较为安全、高效的病毒载体。利用带有E1 基因的293 细胞作为包装细胞，通过倍比扩增，富集病毒颗粒，并通过CsCl 梯度离心，透析进行分离纯化。对绝大多数的细胞株可以达到近乎100％的感染效率。但需要指出的是Adeasy 同样具有所有病毒载体或转染试剂都不可避免的细胞毒性问题。 二、所需试剂：1. 293 细胞；2. 重组好的腺病毒质粒；3. Pac I 限制性内切酶；4. 质粒回收相关试剂；5. 细胞培养、转染相关试剂；6. TBS：10mM Tris, 0.9% NaCl，pH8.1；7. 40% CsCl：28.45 g CsCl 溶于42.7 ml 的TBS 中，4 度保存；8. 15% CsCl：9.085 g CsCl 溶于47.69 ml 的TBS 中，4 度保存；9. Beckman 离心管：1undefined89 mm，SW41 转头；10. Polybrene (sigma)，10 mg/ml；11. 透析袋：Spectrum Co. （成卷供应，带少

一、慢病毒的储存与稀释：1. 病毒的储存：用户收到病毒液后在很短时间内即使用慢病毒进行实验，可以将病毒暂时放置于4 ℃保存；如需长期保存请放置于-80℃（病毒置于冻存管，并使用封口膜封口）注：A．病毒可以存放于-80℃ 6个月以上；但如果病毒储存时间超过6个月，我们建议在使用前需要重新滴定病毒滴度。B．反复冻融会降低病毒滴度：每次冻融会降低病毒滴度10%；因此在病毒使用过程中应尽量避免反复冻融，为避免反复冻融我们强烈建议客户收到病毒后按照每次的使用量进行分装。2. 病毒的稀释：用户需要稀释病毒时，请将病毒取出置于冰浴融解后，使用培养目的细胞用PBS或无血清培养基(含血清或含双抗不影响病毒感染)混匀分装后4℃保存(请尽量在三天内用完)，分装后使用。二、慢病毒用于体外（in vitro）实验：感染培养原代细胞和建系细胞1. 慢病毒对各种细胞和组织的亲嗜性不同，用户使用Invabio提供的慢病毒之前可以通过查阅相关文献，了解慢病毒对您的目的细胞的亲嗜性，感染复数（MOI 值）以及在体内（in vivo）注射所需要的病毒量。如果没有相关文献支持，可以通过感染预实验得到合适的感染复数（MOI 值

1 适用范围 本标准规定了禽流感的血凝试验、血凝抑制试验。 本标准适用于禽流感抗体的检测（主要适用于血清样品）。 2 血凝试验 2.1 材料与试剂 2.1.1 器材：普通天平、分析天平、普通离心机、微型振荡器、注射器、冰箱、高压灭菌器、微量移液器及96孔V形血凝反应板。 2.2.2 pH7.2磷酸盐缓冲液(PBS)，配制方法参见附录A。 2.2.3 1%鸡红细胞悬液，配制方法参见附录B。 2.2.4 阿氏液，配制方法参见附录C。 2.2.5 标准禽流感病毒抗原，购入的标准禽流感病毒应检测其血凝效价并进行无菌检验，以检查与所标HA效价是否相符。若不符，应重复检测并到相关实验室验证。2.2 操作程序 A. 取96孔V形微量反应板，用微量移液器在1~12孔每孔加25 μL PBS，共滴8排，后四排的第1列孔再补加25 μL PBS。 B. 吸取25 μL标准禽流感抗原加入到第1列孔中，吹打3~5次充分混匀。 C. 从第1列孔吸取25 μL混匀后的抗原液加到第2列孔中，混匀后吸取25μL加入到第3列孔中，依次进行系列倍比稀释至第11列孔，最后从第11列孔各吸取25 μL弃之，设第12列孔为红细

一、慢病毒包装简介及其用途慢病毒（ Lentivirus ）载体是以 HIV-1 （人类免疫缺陷 I 型病毒）为基础发展起来的基因治疗载体。区别一般的逆转录病毒载体，它对分裂细胞和非分裂细胞均具有感染能力。慢病毒载体的研究发展得很快，研究的也非常深入。该载体可以将外源基因有效地整合到宿主染色体上，从而达到持久性表达。在感染能力方面可有效地感染神经元细胞、肝细胞、心肌细胞、肿瘤细胞、内皮细胞、干细胞等多种类型的细胞，从而达到良好的的基因治疗效果，在美国已经开展了临床研究，效果非常理想，因此具有广阔的应用前景。目前慢病毒也被广泛地应用于表达 RNAi 的研究中。由于有些类型细胞脂质体转染效果差，转移到细胞内的 siRNA 半衰期短，体外合成 siRNA 对基因表达的抑制作用通常是短暂的，因而使其应用受到较大的限制。采用事先在体外构建能够表达 siRNA 的载体，然后转移到细胞内转录 siRNA 的策略，不但使脂质体有效转染的细胞种类增加，而且对基因表达抑制效果也不逊色于体外合成 siRNA ，在长期稳定表达载体的细胞中，甚至可以发挥长期阻断基因表达的作用。在所构建的 siRNA 表达载体中

目的与原理 了解各种类型白细胞的形态特征，掌握血涂片制作方法和白细胞分类计数方法，进行不同鱼类白细胞分类计数和血细胞形态特征、变形率等的观察。 白细胞依据其形状、染色颗粒、细胞质和细胞核的形状大小可以进行分类。通常的分类方法是根据细胞浆中有无特殊的嗜色颗粒，将其分成颗粒细胞和无颗粒细胞。颗粒细胞又依据所含颗粒对染色剂反应特性，被区分为中性粒细胞、嗜酸性粒细胞和嗜碱性粒细胞；无颗粒细胞则分成单核细胞和淋巴细胞。中性粒细胞有较强的吞噬能力，能将侵入机体的微生物消灭掉，并可参与免疫复合物和坏死组织的清除工作。嗜酸性粒细胞的细胞内含有过氧化物酶和酸性磷酸酶，吞噬能力与中性粒细胞相当或稍弱，能吞噬抗原-抗体复合物，此外，嗜酸性粒细胞具有抗炎作用。嗜碱性粒细胞含有多种化学物质，如组织胺、肝素和5-羟色胺等，当抗原-抗体发生反应时，或机体在寒冷环境中时，都能引起嗜碱性粒细胞释放组织胺和肝素。血液中的单核细胞穿出血管壁进入组织，变成巨噬细胞，可对抗组织内的致病物，各种细菌和病毒。淋巴细胞有免疫功能，对异己构型的物质具有杀灭和消除作用。 各种白细胞必须经过染色，才易于区分其类别。常用者为瑞氏（Wrigh

血细胞计数器（也被拼写血球计数仪）是一种蚀刻玻璃室提出双方将举行石英盖玻片完全室地板0.1毫米以上。为9毫米2的总表面积的计数室中进行蚀刻。 图1、 血细胞计数器的尺寸。 浓度的计算是根据上下方的盖玻片的体积。一个大广场（参见图2中的W）拥有量为0.0001毫升（长x宽x高，也就是说，0.1厘米×0.1厘米×0.01厘米）。 在这两种方法中，通过毛细管作用填充血细胞计数器 - 放置填充的吸移管具有良好的悬吊在血细胞计数器的边缘的凹口的细胞混合，然后慢慢地排出一些内容，以便通过毛细作用进入腔室fluidis绘制。 染色的细胞往往有利于可视化和计数。无论是混合细胞用台盼蓝（trypan blue）等体积的[0.4%（重量/体积）tyrypan蓝色在PBS]来确定活/死计数（死细胞是蓝色的），或杀死细胞，用10%福尔马林，然后染色用台盼蓝（trypan blue）或其他染色（以提高所有单元格的可视化。 这里有两个简单的方法，用于计数的基础上用于确定细胞计数的血细胞计数器的表面面积的细胞。其他的计数计划accetable的的。方法的选择取决于细胞浓度 - 该程序的准确性取决于计数细胞

细胞培养技术中，细胞计数是一项基本功，对于标准化培养条件以及需要精确定量的实验来说都非常关键。这里介绍使用血细胞计数器对细胞进行计数的经典方法以及中间一些需要注意的细节。制备细胞悬液：对于贴壁生长的细胞，我们需要首先使用胰酶消化的方法使细胞从培养皿表面脱落根据需要加入合适体积的培养基，将细胞进行中和及稀释，以得到均质的细胞悬液。要求尽可能将细胞吹打散开，不要残留任何细胞团准备血细胞计数器：使用70%乙醇将盖玻片和血细胞计数器清洁干净将将盖玻片润湿（使用水或呼一口气，目的是使盖玻片与血细胞计数器接触更紧密，易于粘连），并覆盖至血细胞计数器上台盼兰染色（可选）：如果需要计算细胞的活力，则需要将细胞悬液和0.4%台盼兰等体积混合室温孵育3-5分钟，使台盼兰完全进入死细胞，使死细胞着蓝色血细胞计数器加样：使用吸管将细胞悬液或细胞/台盼兰混合液滴加到血细胞计数器计数池的边缘。此时液滴将在虹吸的作用下进入盖玻片下方的计数池以同样的方式在另一侧的计数池中也加入细胞悬液将计数板放置几分钟使细胞完全扩散，同时用吸水纸吸除多余的液体细胞计数：在100倍显微镜下，移动计数板将视野对准计数板的中央大方块，该方

实验目的 掌握细胞计数的方法。 了解区分细胞存活状态的方法。实验用品 0.4%台盼蓝溶液、无水乙醇或95%乙醇溶液、脱脂棉 普通显微镜、试管、吸管、毛细吸管、细胞计数板、绸布。实验原理 在细胞培养工作中，常需要了解细胞生活状态和鉴别细胞死活，确定细胞接种浓度和数量以及了解细胞存活率和增殖度，如用酶消化制备的细胞悬液中细胞活力的鉴别，冻存细胞复苏后的活力检测等。细胞悬液制备后，常用活体染料台盼蓝对细胞进行染色，进行细胞计数。台盼蓝不能透过活细胞正常完整的细胞膜，故活细胞不着色。而死亡细胞的细胞膜通透性增高，可使染料进入细胞内而使细胞着色（蓝色）。细胞计数一般用血细胞计数板，按白细胞计数方法进行计数，便于确定细胞的生活状况。 实验内容与方法 （一）制备动物细胞悬液 将动物细胞用生物盐水制备成适当浓度的细胞悬液备用。 （二）细胞计数 1. 计数板处理 用无水乙醇或95%乙醇溶液擦拭计数板后，用绸布擦净，另擦净盖玻片一张，把盖片覆在计数板上面。 2. 染色 用滴管吸取0.4%台盼蓝染液，按1∶1比例加入细胞悬液中。从计数板边缘缓缓滴入，使之充满计数板和盖片之间的空隙中。注意不要使液

将克隆化基因插入合适载体后导入大肠杆菌用于表达大量蛋白质的方法一般称为原核表达。这种方法在蛋白纯化、定位及功能分析等方面都有应用。大肠杆菌用于表达重组蛋白有以下特点： 易于生长和控制；用于细菌培养的材料不及哺乳动物细胞系统的材料昂贵；有各种各样的大肠杆菌菌株及与之匹配的具各种特性的质粒可供选择。但是，在大肠杆菌中表达的蛋白由于缺少修饰和糖基化、磷酸化等翻译后加工，常形成包涵体而影响表达蛋白的生物学活性及构象。 表达载体在基因工程中具有十分重要的作用，原核表达载体通常为质粒，典型的表达载体应具有以下几种元件： （1）选择标志的编码序列； （2）可控转录的启动子； （3）转录调控序列(转录终止子，核糖体结合位点)； （4）一个多限制酶切位点接头； （5）宿主体内自主复制的序列。 原核表达一般程序如下： 获得目的基因－准备表达载体－将目的基因插入表达载体中（测序验证）－转化表达宿主菌－诱导靶蛋白的表达－表达蛋白的分析－扩增、纯化、进一步检测 一、试剂准备 1、LB培养基。 2、100mM IPTG（异丙基硫代-β-D-半乳糖苷）：2.38g IPTG溶于100ml ddH2O中，0.22μm

一、酶免疫组化的关键环节1、标本固定：固定的目的是①防止标本从玻片上脱落；②除去防碍抗原-抗体结合的类脂，使抗原抗体结合物易于获得良好的染色结果；③固定的标本易于保存。2、脱水、石蜡包埋和制片：脱水用梯度乙醇（由低到高）充分脱水、对组织要完全浸蜡、切片时刀片要干净和锋利。否则，容易裂片和脱片等。3、脱蜡和水化：这是为了后面的抗体等试剂能够充分与组织中抗原等结合反应。脱蜡可以先 60 度 20 min，然后立即二甲苯 1-3 分别 10min，但当天制好的切片可以 60 度 3-4h。水化用梯度乙醇（由高到低）。若脱蜡和水化不全易出现局灶性反应和浸洗不全，而产生非特异性背景着色。4、抗原修复：由于组织中部分抗原在甲醛或多聚甲醛固定过程中，发生了蛋白之间交联及醛基的封闭作用，从而失去抗原性；通过抗原修复，使得细胞内抗原决定族重新暴露，提高抗原检测率。常用的修复方法从强到弱一般分为三种，高压修复、微波修复、胰酶修复。修复液也分为若干种（具体的可以查阅相关资料，大量的：中性的、高 pH 的等）。我们实验室一般用微波修复中火 6 miundefined4 次，效果不错。注意微波修复后自然冷却 30 min 左

母种培养基的配制同一种菌类培养基的配方虽然有多种多样，但必须含有各种菌丝生长所需要的养分、水分和适宜的酸碱度。马铃薯、葡萄糖、琼脂作为各类母种的培养基最为普遍，菌丝都能正常生长。现将常用的培养基配方和配制方法举例介绍。1.马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA培养基)马铃薯(去皮)：200g葡萄糖：20g琼脂：20g水：1000mLpH值：自然2.马铃薯蔗糖琼脂培养基(PSA培养基)马铃薯(去皮)：200g蔗糖：20g琼脂：20g水：1000mLpH值：自然以上两种培养基广泛应用于各种菇、耳、猴头类食用菌的培养。其具体制作方法是：将200g马铃薯去皮，去芽眼，切成小条放入铝锅中，加入1000mL水，煮沸20～30分钟左右至马铃薯软而不烂时，用6～8层纱布过滤，取滤汁于锅中，补水至1000mL，加入琼脂熔化，再加入糖搅拌均匀，趁热分装于试管中。

相关专题酵母细胞的培养专题本文主要介绍了四种酵母培养基的配制方法与原理，主要包括麦芽汁培养基、马铃薯葡萄糖培养基、豆芽汁葡萄糖培养基和察氏培养基的制备原理和方法。具体如下：一、目的要求了解合成培养基、半合成培养基和天然培养基的配制原理。学习和掌握麦芽汁培养基、马铃薯葡萄糖培养基、豆芽汁葡萄糖培养基和察氏培养基的配制方法。二、基本原理麦芽汁培养基和马铃薯葡萄糖培养基被广泛用于培养酵母菌 和霉菌。马铃薯葡萄糖培养基有时也可用于培养放线菌。豆芽汁葡萄糖培养基也是培养酵母菌及霉菌的一种优良培养基。察氏培养基主要用于培养霉菌观察形态用。麦芽汁培养基为天然培养基，马铃薯葡萄糖培养基和豆芽汁葡萄糖培养基二者均为半合成培养基，而察氏培养基则为合成培养基。培养基配方中出现的自然pH系指培养基不经酸、碱调节而自然呈现的pH。三、实验材料(一) 药品葡萄搪、蔗糖、NaN03、K2HP04、KCl、MgSO4·7H2O，FeS04、琼脂 。(二) 仪器天平、高压蒸汽灭菌锅。(三) 玻璃器皿移液管、试管、锥形瓶、烧杯、量筒、培养皿、玻璃漏斗等。(四) 其他物品药匙、pH试纸、称量纸、记号笔、棉花、纱布、线绳、塑

相关专题miRNARNA一度被认为仅仅是DNA和蛋白质之间的“过渡”，但越来越多的证据清楚的表明，RNA在生命的进程中扮演的角色远比RNA我们早前设想的更为重要。RNA干扰（RNA interference）的发现使得人们对RNA调控基因表达的功能有了全新的认识，更因为可以简化替代基因敲除而成为研究基因功能的有力工具，因此格外引人注意，在2002年度Science评选的10大科学成就中RNAi名列榜首。随着对小分子RNA研究的不断深入，研究人员开始认识到：小分子RNA的世界一点都不小。有人推测：小分子RNA可能代表发现了一个新层次上的基因表达调控方式。已经有很多文章介绍有关siRNAs以及其在RNA干扰中的作用以及研究应用方法，在这里将介绍另一种越来越引人注目――micro RNA。什么是miRNA Micro RNAs (miRNAs)是一种大小约21―23个碱基的单链小分子RNA，是由具有发夹结构的约70-90个碱基大小的单链RNA前体经过Dicer酶加工后生成，不同于siRNA（双链）但是和siRNA密切相关。据推测，这些非编码小分子RNA（miRNAs）参与调控基因表达，但其机

自 1998 年 Fire 和 Mello 首次提出 RNAi(RNA interference，RNA 干扰) 概念以来，越来越多的人开始重视小 RNA 的研究，之后 RNAi 在基因功能的研究中也得到广泛应用。RNAi 是一种存在于真核生物中的转录后基因沉默现象，在生物进化过程中能够抵御病毒感染及防止基因组中由于逆转座子元件扩增引起的不稳定。在 miRNA(microRNA)、siRNA(small interfering RNA) 等小 RNA 的介导下，RNAi 能够特异性地调控 mRNA 基因在表观遗传学水平、转录水平及转录后水平的表达。小干扰 RNA(Small interfering RNA;siRNA) 与靶向特异性的 mRNA 结合，通过 RNA 介导的沉默复合体 RISC(RNA-induce siliencing complex) 介导 mRNA 的降解。siRNA 长度一般为 21 - 23nt，被 RISC 识别结合之后，siRNA 发生解旋。RISC 在 siRNA 的反义链指导下，寻找具有同源序列的内源性的 mRNA，并在距离 5』端 10 - 11 位碱

体外制备 1.化学合成 许多国外公司都可以根据用户要求提供高质量的化学合成siRNA。主要的缺点包括价格高，定制周期长，特别是有特殊需求的。由于价格比其他方法高，为一个基因合成3―4对siRNAs 的成本就更高了，比较常见的做法是用其他方法筛选出最有效的序列再进行化学合成。 最适用于：已经找到最有效的siRNA的情况下，需要大量siRNA进行研究 不适用于：筛选siRNA等长时间的研究，主要原因是价格因素 2.体外转录 以DNA Oligo为模版，通过体外转录合成siRNAs，成本相对化学合成法而言比较低，而且能够比化学合成法更快的得到siRNAs。不足之处是实验的规模受到限制，虽然一次体外转录合成能提供足够做数百次转染的siRNAs，但是反应规模和量始终有一定的限制。而且和化学合成相比，还是需要占用研究人员相当的时间。值得一提的是体外转录得到的siRNAs毒性小，稳定性好，效率高，只需要化学合成的siRNA量的1/10就可以达到化学合成siRNA所能达到的效果，从而使转染效率更高。 最适用于：筛选siRNAs，特别是需要制备多种siRNAs，化学合成的价格成为障碍时。 不适用于：实验

实验目的：掌握由动物组织中提取总RNA的方法 实验原理：Trizol试剂是一个包含酚、异硫氰酸胍和SDS的单相酸性溶液，其在裂解细胞的同时抑制RNase的活性，随后加入氯仿，酚会大量的溶解在氯仿中。由于DNA和RNA在酸性酚中的溶解性不同，造成DNA分布在下层的氯仿酚溶液中，RNA则分布在上层的水相中，最后用异丙醇沉淀水相中的RNA，并用70%乙醇洗涤沉淀，这样就可以得到比较纯净的总RNA. 实验步骤：① 先在研钵中加入液氮，再将组织剪成小块在液氮中磨成粉末，用液氮预冷的药匙取50～100mg组织粉末加入已盛有1ml的Trizol液的EP管中（注意组织粉末总体积不能超过所用Trizol体积的10%），充分混合均匀。② 室温放置5min，然后加入200??l的氯仿，盖紧EP管并剧烈摇荡15秒钟。③ 12000rpm离心10min，取上层水相于一新的EP管中（千万不要将中间的沉淀层和下层液混入，否则重新离心分离），加入500??l异丙醇，温和颠倒混匀。室温放置10min，12000rpm离心10min。④ 小心地弃去上清液，加入1ml的75%乙醇，涡旋混匀，4℃下12000rpm离心5mi