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浅谈流式核内蛋白染色步骤：1、染表面抗体 按说明书条件孵育全血样品孵育抗体后加入不含固定剂的溶血素（按厂家说明操作）溶血完毕。2、用2ml预冷流式染色缓冲液（Flow Cytometry Staining Buffer）洗涤细胞300-400g离心5分钟，去上清。3、用3倍体积的固定/破膜稀释液（#00-5223）稀释固定/破膜浓缩液（#00-5123）制成固定/破膜工作液，注意要新鲜配制，每个样本的用量为1ml 。4、旋涡震荡重悬细胞后加入1ml的固定/破膜工作液（1:3稀释好）再次旋涡混匀，避光4℃孵育30分钟到60分钟。5、将破膜缓冲液（#00-8333）用去离子水1:9稀释，制成工作液（每个样本的用量为4~5ml）。6、无需洗涤，直接加入2ml破膜缓冲液工作液（1：9稀释好）300-400g离心洗涤细胞并弃去上清液（可选）重复洗涤一次。7、加入100 ul流式染色缓冲液重悬细胞体系中加入2 ul 胞内抗体来源的血清，室温避光孵育30分钟。8、体系加入适量的核内（及胞浆）抗原抗体，对照管加入等量的同型对照，按说明书条件孵育。9、加入2ml破膜缓冲液工作液离心洗涤细胞并弃去上清液（

一、原理1、E .coli 表达系统E .coli 是重要的原核表达体系。在重组基因转化入E .coli 菌株以后，通过温度的控制，诱导其在宿主菌内表达目的蛋白质，将表达样品进行SDS-PAGE 以检测表达蛋白质。2、外源基因的诱导表达提高外源基因表达水平的基本手段之一，就是将宿主菌的生长与外源基因的表达分成两个阶段，以减轻宿主菌的负荷。常用的有温度诱导和药物诱导。本实验采用异丙基硫代-β-D-半乳糖昔（IPTG）诱导外源基因表达。不同的表达质粒表达方法并不完全相同，因启动子不同，诱导表达要根据具体情况而定。二、材料1、诱导表达材料(1 )LB （Luria—Bertani）)培养基酵母膏 (Yeast extract)5g 蛋白胨 (Peptone)10gNaCl10g 琼脂 (Agar)1-2%蒸馏水 (Distilled water)1000ml pH 7.0适用范围：大肠杆菌(2 )IPTG 贮备液：2 g IPTG溶于10 ml 蒸馏水中，0 .22 μm 滤膜过滤除菌，分装成1 ml /份，－20 ℃ 保存。(3 )l× 凝胶电泳加样缓冲液：50 mmol / L Tris

一、SP 法1）脱蜡、水化；2）PBS 洗 2～3 次各 5 分钟；3）3% H2O2（80% 甲醇）滴加在 TMA 上，室温静置 10 分钟；4）PBS 洗 2～3 次各 5 分钟；5）抗原修复；6）PBS 洗 2～3 次各5分钟；7）滴加正常山羊血清封闭液,室温 20 分钟。甩去多余液体。8）滴加Ⅰ抗 50μl，室温静置 1 小时或者4℃过夜或者37℃1小时。9）4℃ 过夜后需在37℃复温45分钟。10）PBS 洗 3 次各 5 分钟；11）滴加 Ⅱ 抗 40～50 μl，室温静置，或 37℃ 1 小时；12）II抗中可加入 0.05% 的 tween-20。13）PBS 洗 3 次各 5 分钟；14）DAB 显色 5～10 分钟，在显微镜下掌握染色程度；15）PBS或自来水冲洗 10 分钟；16）苏木精复染 2 分钟，盐酸酒精分化；17）自来水冲洗 10～15 分钟；18）脱水、透明、封片、镜检。二、SABC法1）脱蜡、水化。2）PBS 洗两次各 5 分钟。3）用蒸馏水或PBS配置新鲜的3%H2O2，室温封闭5～10分钟，蒸馏水洗3次。4）抗原修复。5）PBS洗5分钟。6）滴加正

ELISA检测系统可谓是免疫学反应应用到科研生产中最为广泛最为灵敏的技术手段。可是在新老手操作过程中总是会出现或大或小的问题,本人在刚开始做ELISA时就面临很多困难,虽然有师兄师姐铺路,但还是常常做得一塌糊涂,比如说花板,假阳性,全显色,全部显色,显色比空白还低......自己也为此苦恼过很长一段时间,随着自己技术水平得提高,或多或少地也掌握了ELISA体系的脾气,也是熟能生巧吧,现在做方阵,做ELISA已是轻车熟路了,以前检测一种抗体用整整一下午还算得晕晕的,现在给我十个八个的从包被到显色,一个工作日基本搞定.下面就由我抛砖引玉地来说一下,做ELISA的经验总结:1.包被原的性质很重要,蛋白浓度,是否降解,这关系到你做出的抗体可不可以被其识别,所以保存抗原很重要,我做重组蛋白时,师兄都严格警告我一定要在冰浴下缓慢融化就是这个道理.还有有的包被原可能不是蛋白,对于生物素和脂类物质或小分子物质我们要事先对其改造再加以包被,我把方法简要的列出如下:①亲和素生物素:先亲和素先包被载体，加入生物素化的DNA，这种包被方法均匀、牢固，已扩大应用于各种抗原物质的定量测定。②脂类物质:可将其在有机

实验流程：多靶点免疫荧光染色的实验操作与普通单标记免疫组化流程相似。试剂盒中的荧光染料可以在HRP酶的作用下将信号共价结合到抗原上，随后即可衔接下一轮单标染色，直至全部标记完成，即可复染DAPI后封片观察。1.脱蜡水合：1）新鲜二甲苯浸片10min,重复3次。2）梯度乙醇浸片，100% 5min；95% 5min；70% 2min。3）灭菌水洗片1min，重复3次。4）10%中性福尔马林浸片10min，灭菌水洗片1min，重复3次。2.微波修复：1)将脱蜡水合后的玻片置于修复杯中，用抗原修复液1×工作液浸没。2）将修复杯置于微波炉内高火煮沸。3）低火维持15min。4）取出室温自然冷却至室温。3.封闭：1）去除玻片上残存洗液。2）用组画笔圈出玻片上的样本区域，滴加封闭剂，覆盖样本区域。3）室温保湿震荡10min。4.一抗孵育：1）去除玻片上的封闭剂。2）用移液器滴加稀释的一抗溶液，浸没样本区域。3) 37℃恒温保湿震荡孵育1hr。4）用1×TBST buffer浸洗玻片3min，重复1次。5.二抗孵育：1）去除玻片上残存的洗液。2）直接滴加二抗溶液，浸没样本区域。3）室温保湿震荡孵育1

样本RNA提取、去除残留DNA及RNA质检后，我们需要决定是否以及如何去富集感兴趣的RNA。总RNA中含有大量的核糖体 RNA (rRNA)，约占总RNA 80 – 98%的比例。对绝大多数 RNA-Seq 应用来说，需要去除 rRNA 或富集mRNA，以将测序资源集中在转录组所需的部分并节省成本。除核糖体 RNA 外，样本还可能含有其他丰富的转录本，例如，血液样本中的珠蛋白 mRNA 可占所有 mRNA 分子的 30 – 80%。如果不除去这些占比很大的globin mRNA，我们测序 ...

NGS已成为生命科学领域中基因组学和转录组学研究的金标准。虽然它与桑格测序等方法有某些核心相似之处，但NGS所能实现的绝对的高通量水平使它与其他方法截然不同，并彻底改变了科学家的工作方式。RNA测序(RNA-seq)尤其处于NGS功能应用的前言沿。RNA-seq最简单的形式允许我们在取样时确定样本中的RNAs的丰度。转录组是一个高度动态的细胞特征，并打开了一个巨大发掘潜力的世界。对药物、各种疾病状态、转录后修饰 ...

一、目的研究基因的表达和调控时，需要从组织或细胞中分离纯化 RNA。RNA 质量的高低经常影响 RT-PCR、cDNA 库构建和 Northern Blot 等分子生物学实验的成败。 二、主要试剂Trizol 是一种新型总 RNA 抽提试剂，内含异硫氰酸胍等物质，能迅速破碎细胞，抑制细胞释放出的核酸酶。 1. Trizol 试剂含有苯酚，具有毒性和刺激性，注重操作。 2. RNase 污染的主要来源是操作过程中手和空气中的浮沉，注重配带手套，样品尽可能盖严。 3. 细胞裂解必需充分且操作迅速。裂解不完全会降低最后得率，因为一部分 RNA 会残留在未裂解的细胞中。细胞裂解之后要看不见颗粒状物质（结缔组织和骨除外）。在清洗和裂解细胞时最好在低温下操作，防止在操作过程中释放的内源 RNase 降解了 RNA。 4. 酵母和一些细菌由于细胞壁的特别结构，可以加入 Trizol 试剂同时加入无 RNase 的玻璃珠并剧烈振荡，使细胞裂解充分。2-8℃ 避光保存一年。 三、预备工作RNA酶（Rnase）是导致 RNA 降解最主要的物质。此酶非常稳定，在一些极端的条件下只可暂时失活，但限制因素去除

RNA的提取准备试剂：氯仿，异丙醇，75%乙醇，无RNase的水或0.5%SDS(溶液均需用DEPC处理过的水配制) 操作步骤： 1. 匀浆处理： ① 组织 将组织在液氮中磨碎，每50-100mg组织加入1ml TRIzol，用匀浆仪进行匀浆处理。样品体积不应超过TRIzol体积10%。 ② 单层培养细胞 直接在培养板中加入TRIzol裂解细胞，每10cm2面积(即3.5cm直径的培养板)加1ml，用移液器吸打几次。TRIzol的用量应根据培养板面积而定，不取决于细胞数。TRIzol加量不足可能导致提取的RNA有DNA污染。 ③ 细胞悬液 离心收集细胞，每5-10×106 动物、植物、酵母细胞或1×107细菌细胞加入1ml TRIzol，反复吸打。加TRIzol之前不要洗涤细胞以免mRNA降解。一些酵母和细菌细胞需用匀浆仪处理。 2. 将匀浆样品在室温（15-30℃）放置5分钟，使核酸蛋白复合物完全分离。 3. 可选步骤：如样品中含有较多蛋白质，脂肪，多糖或胞外物质（肌肉，植物结节部分等）可于2-8℃10000×g离心10分钟，取上清。离心得到的沉淀中包括细胞外膜，多糖，高分子量DNA

在收集到生物材料之后，最好能即可进行RNA制备工作。若需暂时储存，则应以液氮将生物材料急速冷冻后，储存于-80℃冷冻柜。在制备RNA时，将储存于冷冻柜的材料取出，立即以加入液氮研磨的方式打破细胞，不可以先行解冻，以避免RNase的作用。1. 提取组织RNA时，每50~100mg组织用1ml Trizol试剂对组织进行裂解：提取细胞RNA时，先离心沉淀细胞，每5~106个细胞加1ml Trizol后，反复用枪吹打或剧烈震荡以裂解细胞；2. 将上述组织或细胞的Trizol裂解液转入EP管中，在试问15~30℃下放置5分钟；3. 在上述EP管中，按照每1ml Trizol后加0.2ml氯仿的量加入氯仿，盖上EP管盖子，在手中用力震荡15秒，在室温下（15~30℃）放置2~3分钟后，12000g（2~8℃）离心15分钟；4. 去上层水相置于新EP管中，按照每1ml Trizol加0.5ml异丙醇的量加入异丙醇，在室温下（15~30℃）放置10分钟后，12000g（2~8℃）离心10分钟；5. 弃上清，按照每1ml Trizol加1ml 75% 乙醇进行洗涤，涡旋混合，7500g（2~8℃）离心

一、引言在许多的细胞生命活动中，例如 DNA 复制、mRNA 转录与修饰以及病毒的感染等都涉及到 DNA 与蛋白质之间的相互作用的问题。重组 DNA 技术的发展，人们已分离到了许多重要的基因。现在的关键问题是需要揭示环境因子及发育信号究竟是如何控制基因的转录活性。为此需要：1. 鉴定分析参与基因表达调控的 DNA 元件。2. 分离并鉴定这些顺式元件特异性结合的蛋白质因子。这些问题的研究都涉及到 DNA 与蛋白质之间的相互作用。研究 DNA-蛋白质相互作用的实验方法主要包括：1. 凝胶阻滞实验。2. DNase1 足迹实验。3. 甲基化干扰实验。4. 体内足迹实验。5. 拉下实验。 二、凝胶阻滞实验1. 概念：凝胶阻滞实验（Gelretardationassay），要叫做 DNA 迁移率变动试验（DNAmobilityshiftassay）或条带阻滞实验（Bandretardationassay）是在八十年代初期出现的用于在体外研究 DNA 与蛋白质相互作用的一种特殊的凝胶电泳技术。2. 原理：在凝胶电泳中，由于电场的作用，裸露的 DNA 分子向正电极移动距离的大小是同其分子量的对数成反

转染的定义是“将具生物功能的核酸转移或运送到细胞内并使核酸在细胞内维持其生物功能”。其中，核酸包括DNA （质粒和线性双链DNA ），反义寡核苷酸及RNAi（RNA interference）。基因转染技术已广泛应用于基因组功能研究（基因表达调控，基因功能，信号转导和药物筛选研究）和基因治疗研究。基因转染需要一定的转染试剂将带有目的基因的载体运送到细胞内。早期的磷酸钙转染法转染效率很低，且对很多细胞株无效，因此不能满足很多科研工作的需要。目前，最常用的转染试剂是阳离子脂质体和阳离子聚合物，它们在克服细胞屏障方面跟病毒有很相象的特征，容易透过细胞膜。其中，阳离子脂质体在体外基因转染中有很高的效率，然而在体内，它迅速被血清清除，在肺组织内累积，诱发强烈的抗炎反应，这将导致高水平的毒性，因此，在很大程度上限制了其应用。由于阳离子脂质体的局限性，阳离子聚合物转染试剂日益受到重视。转化特指将质粒DNA 或以其为载体构建的重组DNA 导入细菌体内，使之获得新的遗传特性的一种方法。它是微生物遗传、分子遗传、基因工程等研究领域的基本实验技术之一。受体细胞经过一些特殊方法（如：电击法，CaCl2等化学试

Purpose Materials10ml 6% dextran + 7ml citrate/citric acidDextran: T500 --> 6g+100ml PBSCitrate solution: 25g Na Citrate + 8g citric acid + 500 ml PBS 43 ml blood 12 ml RT Histopaque 107718 ml cold H2 O2 ml 10x PBSM199 for HUVECs: 1L powder pocket M199 + 35g NaHCO3 + 25mM Hepes + 5 mM glutamine + 50 ug/ml Gentamycin.1M Hepes: 119.1 g Hepes + 500 ml dH2 O.Media A: 1X HBSS (10X:50ml) + 10 mM Hepes (1M: 5 ml) + 5 mM EDTA (0.5M: 5ml) + 2.5 % FBS (12.5 ml) in 500 ml.Media B: RPMI1640 470 ml + Ge

一、环境和液流的消毒1、准备足量的无菌1×PBS（3L左右）和去离子水（10L左右）。PBS和去离子水可高压灭菌，sheath桶和装DI水的5L小桶依次用75％ 医用酒精和无菌去离子水各涮洗三次，然后将无菌PBS和去离子水分别注入相应桶内即可。2、房间在分选前紫外灯照射15－20分钟；用1:50新洁尔灭拖地；用75％ 医用酒精擦拭工作台和收集架；用75％ 医用酒精喷洒分选细胞收集区和上样区。二、开机和管道的消毒1、将Sheath液换为活性氯浓度为0.5% 的次氯酸钠溶液（不要用75％ 的酒精），开机。开机前，先掀起流动室和分选室的罩盖，开启电源，打开计算机并等计算机进入WINDOWS系统后，打开激光电源，运行FACSDiva软件，联机成功后，执行Fluidics startup命令。然后从FACSDiva的sort菜单进入sort setup，选择合适的液流压力（high、 middle、low）。一般来说，100 μm的喷嘴选用Low，而70 μm的喷嘴选用middle。2、打开breakoff window，点击显示窗上的液流开关，检查液流是否正好流入废液槽中间和液流的形态是否正常

1. 原理RT—PCR 是一种将 cDNA 合成与 PCR 技术结合分析基因表达的快速灵敏的方法，主要用于对表达信息进行检测或定量分析, 还可以用来检测基因表达差异而不必构建 cDNA 文库克隆 cDNA。 RT-PCR 的模板可以为总 RNA 或 poly(A) 选择性 RNA 。逆转录反应可以使用逆转录酶，以随机引物、oligo(dT) 或基因特异性的引物（GSP）起始。 在实际应用中，RT—PCR 又常常分为一步法 RT—PCR 和两步法 RT—PCR。2. 特点一步法 RT—PCR 反应更加快速、灵敏，操作简便，污染率低，RNA 二级结构减少，并且因为聚合酶有校正活性，从而降低了 PCR 反应的错配率。而在两步法中，反应的精确度高，人为的误差相对较小，并且由于在第一步中将 RNA 反转录为 cDNA，从而更易于保存。 另外，两步法的整个过程比一步法更节省费用。传统检测方法的样品用量一般在 ug 级，而在 RT—PCR 检测系统中样品用量陡降至 pg 级。这就在很大程度上降低了实验操作的难度，特别是 mRNA 样品制备的过程得以简化。3. 应用对基因转录产物进行定性与定量的检测，

聚合酶链式反应 (Polymerase Chain Reaction，PCR) 可对特定核苷酸片断进行指数级的扩增。在扩增反应结束之后，我们可以通过凝胶电泳的方法对扩增产物进行定性的分析，也可以通过放射性核素掺入标记后的光密度扫描来进行定量的分析。 无论定性还是定量分析，分析的都是 PCR 终产物。但是在许多情况下，我们所感兴趣的是未经 PCR 信号放大之前的起始模板量。例如我们想知道某一转基因动植物转基因的拷贝数或者某一特定基因在特定组织中的表达量。在这种需求下荧光定量 PCR 技术应运而生。 实时荧光定量 PCR 技术（Real-time quantitative Polymerase Chain Reaction 简称 Real Time PCR）是在定性 PCR 技术基础上发展起来的核酸定量技术。 实时荧光定量 PCR 技术于 1996 年由美国 Applied biosystems 公司推出，在 PCR 反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个 PCR 进程，使每一个循环变得「可见」，最后通过 Ct 值和标准曲线对样品中的 DNA(or cDNA) 的起始浓度进行

由于 Real-time qPCR 的众多优点，现在已经是生命科学领域的一项常规技术。越来越多的研究文章中涉及 RT-PCR 的实验，也基本上被 real-time qPCR 所代替。由于 real-time aPCR 输出的数据不同于常规的 PCR 电泳检测，很多没有做过 real-time qPCR 的研究者常常感到高深莫测，不知从何入手；甚至一些做过次实验的研究者也会对数据处理分析感到迷惑，不知所措。 本文就从 real-time qPCR 的发展史说起，包括 real-time qPCR 的原理，实验设计，实际操作，数据分析，常见问题解答五个方面，手把手教你从各个方面了解 real-time qPCR，彻底的从菜鸟到高手！ 一、Real-time qPCR发展史 Real-time qPCR 就是在 PCR 扩增过程中，通过荧光信号，对 PCR 进程进行实时检测。由于在 PCR 扩增的指数时期，模板的 Ct 值和该模板的起始拷贝数存在线性关系，所以成为定量的依据。由于常规的PCR的缺点，real-time qPCR 由于其操作简便，灵敏度高，重复性好等优点发展非常迅速。现在已经

内参就是内部参照，一般是指管家基因编码表达的蛋白，它们在各个组织和细胞中的表达相对恒定，在检测蛋白的表达水平变化时常用它来做参照参。内参则可以校正蛋白质定量、上样过程中存在的误差，保证实验结果的准确性。此外，内参可以作为空白对照，还可以检测蛋白转膜情况是否完全、整个 WB 显色发光体系是否正常。内参抗体种类很多，比如 β-Actin、β-Tubulin、GAPDH 等，下面简单介绍下如何选择内参。 一、目的蛋白分子量选择内参抗体时，应该考虑目的蛋白分子量的大小。通常应该保证目的蛋白与内参蛋白分子量相差 5KDa 以上。比如检测目的蛋白分子量为 45KDa，此时不适宜选择 β-actin（42KDa）作为内参，可以考虑选择 GAPDH（36KDa）作为内参。二、种属不同种属的样本内参蛋白不同。如哺乳动物的组织或者细胞样本，通常选择 β-actin、β-tubulin、GAPDH；植物来源实验样本，则可以选择 Plant actin、Rubisco等。 三、定位不同表达部位内参蛋白不同 四、样品前处理（常常被忽略的内参选择因素）内参的选择还需要考虑实际的实验环境和样品的前处理。在某些特

基因工程的诞生基因工程是分子水平对生物遗传作人为干预，要认识它，我们先从生物工程谈起：生物工程又称生物技术，是一门应用现代生命科学原理和信息及化工等技术，利用活细胞或其产生的酶来对廉价原材料进行不同程度的加工，提供大量有用产品的综合性工程技术。生物工程的基础是现代生命科学、技术科学和信息科学。生物工程的主要产品是为社会提供大量优质发酵产品，例如生化药物、化工原料、能源、生物防治剂以及食品和饮料，还可以为人类提供治理环境、提取金属、临床诊断、基因治疗和改良农作物品种等社会服务。 生物工程主要有基因工程、细胞工程、酶工程、蛋白质工程和微生物工程等 5 个部分。其中基因工程就是人们对生物基因进行改造，利用生物生产人们想要的特殊产品。随着 DNA 的内部结构和遗传机制的秘密一点一点呈现在人们眼前，特别是当人们了解到遗传密码是由信使 RNA 转录表达的以后，生物学家不再仅仅满足于探索、提示生物遗传的秘密，而是开始跃跃欲试，设想在分子的水平上去干预生物的遗传特性。如果将一种生物的 DNA 中的某个遗传密码片断连接到另外一种生物的 DNA 链上去，将 DNA 重新组织一下，不就可以按照人类的愿望，设

随着人类基因组计划取得巨大的成功和许多物种基因组测序的完成，仅仅靠基因组的序列来试图阐明生命现象是远远不够的，因此，研究重心已经开始从揭示生命的所有遗传信息转移到在分子整体水平对功能的研究上，生命科学已实质性地跨入了后基因组时代。尽管现在已经有多个物种的基因组被测序，但这些基因组中通常有一半以上基因的功能是未知的。目前功能基因组研究中所采用的策略，如微阵列法（microarray）（Wodicka et al.,1997）、基因芯片（gene chips）（Ramsay et al.,1998）、基因表达序列分析（SAGE）（Velculescu et al.,1995）等，都是从细胞中mRNA的角度来考虑的。但事实上，从DNA、mRNA到蛋白质存在三个层次的调控，mRNA自身也存在着贮存、转运和降解等问题，从mRNA角度考虑，实际上仅包括了转录水平调控，并不能全面代表蛋白质表达水平。实验也证明，组织中mRNA丰度与蛋白质丰度的相关性并不好，尤其对于低丰度蛋白质来说，相关性更差。蛋白质复杂的翻译后修饰，蛋白质的亚细胞定位或迁移，蛋白质-蛋白质相互作用则几乎无法从mRNA水平来判断（曾嵘