Nature Methods-让胚胎干细胞茁壮成长，一个神奇的小分子配方介绍

1. 药物筛选

陈宁博士团队首先建立了一种高通量细胞存活筛选体系(Cell-surivival assay qHTS) ，通过CTG(CELL TITER-GLO)发光法评估15, 333种化合物对细胞活力的影响，发现总共有113种类型能够提高细胞存活率。而其中Chroman 1对ROCK通路比Y-27632具有更好的抑制效果和选择性。随后，作者从113个活性化合物中，挑选了29个作用不同靶点的化合物进行了组合小分子基质筛选(Combinatorial small-molecule matrix screening)，发现Chroman 1与Caspase阻滞剂Emricasan有显著的协同作用。Caspase的检测结果显示，Chroman1和Emricasan（下文简称C+E）的联合使用可以减少hPSCs的凋亡。 

根据之前的研究结果，针对C+E组合，与剩下的活性化合物进行干细胞存活二级组合筛选，发现C+E与Trans-ISRIB和Polyamines组合会有更优的效果，更高的关联度。

2. CEPT促进细胞贴壁活力

在这里，作者选择了来自Axion BioSystems的高通量细胞活力检测系统Maestro Z（图1a）来比较细胞贴壁能力的差异。图1b结果显示，相同数量的hPSC增殖进入平台期后，CEPT 处理组具有最高的阻抗值。也就是说其平台期的细胞数量相对Y-27632 组和Chroman 1 组来说要多60%和30%左右。

3. CEPT改善冻存复苏后心肌细胞电活动

冻存的iPSC-CMs复苏后种在MEA板上，五天后使用Axion BioSystems的高通量微电极阵列系统Maestro MEA对其电活动进行评估。相比较DMSO对照组，CEPT处理组活跃电极数及Spike振幅分别增加了约100%（图2i-k）。说明CEPT在提高hSPCs细胞增殖活力及数量的同时，还能改善其分化后心肌细胞的电生理功能。

编者按：基于Maestro MEA的高密度电极阵列，作者得以通过数据的质控来定义活跃电极（本文为spike amplitude ≥300μV），从而极大地提高了MEA实验的准确度和可重复性。

4. CEPT改善冻存复苏后运动神经元电活动

iPSC诱导的运动神经元经CEPT、Y-27632等孵育24h后，置于Maestro MEA设备进行电活动检测。相较于DMSO组和Y-27632组，经过CEPT处理的运动神经元簇内spike均值分别增加63%和98%（图3a&b）。说明CEPT也可显著增强iPSC衍生神经元的电活动。

 

研究结论

 

上述实验结果证实CEPT能够显著地提升hPSCs在冻存复苏和单细胞克隆过程中的存活率。CEPT未来可应用于普通细胞系传代、诱导干细胞生成、类器官形成、EB形成、干细胞基因编辑、单细胞克隆及冻存人源胚胎干细胞的表型功能研究等方向（图4）。

编者按：在干细胞活力分析以及iPSC衍生神经元/心肌细胞的电生理功能检测应用方面，Axion公司可以提供量身定做的专业解决方案。Maestro系列离体生物电系统的诞生将有助于加快可重复的干细胞实验和临床应用的研究进程。

Maestro Z阻抗实验方法

       首先使用VN包被CytoView-Z 96孔板5μg/cm²，37°C下孵育过夜。随后去除VN溶液，并向每个孔中添加100μl 2x E8培养基。将细胞板置于Maestro Z设备测量阻抗基线。

       接着将Accutase加入细胞培养皿，解离10分钟后收集细胞，并使用E8培养基重悬至100,000/ml。取出CytoView-Z 板，每孔加入100ul细胞悬液进行种板（10,000个/孔）。室温下静置1小时以确保细胞均匀覆盖后，将细胞板放回Maestro Z，控制环境为37°C和5％CO2。最后，在10 kHz下连续记录阻抗值36小时。

 

Maestro MEA实验方法

       首先使用8μl 50μg/ ml的Fibronectin包被MEA板，37°C下孵育过夜。

       接着，将冻存的iPSC-CMs置于37℃水浴孵育4分钟后，转移至含有DMSO、Y-27632或CEPT的9mL培养基中轻轻混合。按照63, 000个/cm²的密度进行种板。48h后更换为常规培养基。每2-3天进行半换液处理。

       最后，在种板第7天和第14天进行电生理记录。