全部

脾脏（spleen）位于上腹部左后侧，体积较大，长条形，是体内最大的淋巴器官，也是血流通路中的过滤器官。脾脏内定居着大量的淋巴细胞和其它免疫细胞，是机体发生特异性免疫应答的场所。1 原理单个核细胞的体积、形态和比重与其它细胞不同，在沉降过程中不同比重的细胞会处于不同的分布位置。因此，可利用各种血细胞和单个核细胞比重之间的差异将各种血细胞与单个核细胞分离开来。2 方法1）无菌条件下取出脾脏，在培养皿中加入适量的分离液，将脾 ...

外周血单个核细胞（Peripheral Blood Mononuclear Cell，PBMC），是指外周血中具有单个核的细胞，包括淋巴细胞（Lymphocyte）、单核细胞（Monocyte）、树突状细胞（DC）和其他少量细胞。1 原理单个核细胞的体积、形态和比重与外周血其它细胞不同，红细胞和多核白细胞的比重超过1.080，单个核细胞的比重为1.070左右，血小板为1.030左右。因此，可利用各种血细胞和单个核细胞比重之间的差异将各 ...

01 概述1.1 药物代谢研究简介药物代谢研究是创新药物研发的重要内容，它不仅决定了创新药物制剂研发的成败，而且与创新药物研发的速度和质量有密切关系。因而，药物代谢研究在新药研发工程中具有不可或缺的重要作用，研究药物代谢对于了解药物在体内的变化过程至关重要。药物代谢研究的方法主要分为体内和体外两种。体内代谢法因药物在生物体内的分布较广，加上代谢转化的器官和酶系的多样性，使药物及其代谢产物在体内的浓度比较低，代谢产物 ...

1 概述1.1 药物代谢研究简介药物代谢研究是创新药物研发的重要内容，它不仅决定了创新药物制剂研发的成败，而且与创新药物研发的速度和质量有密切关系。因而，药物代谢研究在新药研发工程中具有不可或缺的重要作用，研究药物代谢对于了解药物在体内的变化过程至关重要。药物代谢研究的方法主要分为体内和体外两种。体内代谢法因药物在生物体内的分布较广，加上代谢转化的器官和酶系的多样性，使药物及其代谢产物在体内的浓度比较低，代谢产物的 ...

01 概述1.1 药物代谢研究简介药物代谢研究是创新药物研发的重要内容，它不仅决定了创新药物制剂研发的成败，而且与创新药物研发的速度和质量有密切关系。因而，药物代谢研究在新药研发工程中具有不可或缺的重要作用，研究药物代谢对于了解药物在体内的变化过程至关重要。药物代谢研究的方法主要分为体内和体外两种。体内代谢法因药物在生物体内的分布较广，加上代谢转化的器官和酶系的多样性，使药物及其代谢产物在体内的浓度比较低，代谢产物 ...

对于科研人员来说，在日常学习和工作中，除了需要阅读权威的专业书籍和著作，很多时候还需要阅读大量的学术文献。尤其是对于那些刚刚接触全新研究领域的科研人员来说，阅读学术文献则是打开这一领域知识宝库、取得研究成果的一块「敲门砖」。然而，当接触从来没有涉足过的研究领域内文献时，很多人往往显得不知所措，也不知道如何去高效地阅读文献。比如，不知道哪些是权威学术期刊、文章里的图表数据看不懂、专业英语单词不会认，以及对最新进展和 ...

养过RAW 264.7细胞系的小伙伴，都容易为一个问题感到苦恼：它太容易分化了！到底怎样才能养好它呢？RAW264.7细胞培养注意事项有哪些，今天我们就给大家分享一些心得。RAW264.7细胞培养之基础篇RAW264.7细胞培养的第一步，是要对它的基础培养条件了如指掌，比如生长特性、细胞形态、所需的培养基，甚至培养环境、传代比例等等，做到知己知彼，才能百战百胜。 ▲产品详情细胞系:RAW 264.7培养基:CM-0190▲RAW26 ...

逆转录反应，作为分子生物学研究的基本技术之一，已经广泛应用到多个研究领域，可以说是科研人员进行 RNA 功能研究的看家本事。众所周知，逆转录的应用领域有以下 6 种：逆转录聚合酶链式反应（RT-PCR）定量RT-PCR（RT-qPCR）cDNA 克隆和文库构建cDNA 末端快速扩增（RACE）基因表达芯片RNA 测序（RNA-Seq）今天，小编就整理了一些贴士，帮助大家在面对 6 种不同的应用时，如何正确选择逆转录酶。逆转录聚合酶链式反应（RT-PCR）在 RT-PCR 中，逆转录酶将 RNA 转化为 cDNA，然后通过 PCR 反应扩增 cDNA，为下游实验提供研究模板，因而逆转录酶是实验成功的关键步骤之一（如下图）。选定的逆转录酶应对所有样本均具有最高效率，即便是难转录 RNA 样本，如降解、抑制剂残留或具有高度二级结构的 RNA 样本。图. 逆转录聚合酶链式反应（RT-PCR）。RT =逆转录，RTase =逆转录酶常用的 RT-PCR 方法分为一步法和两步法，每种方法都各有优缺点，简要概述如下：表. 对比一步法和两步法 RT-PCR 定量 RT-PCR（RT-qPCR）定量 R

为了研究 RNA 的功能，通常需要通过反转录过程将 RNA 转化为更稳定的互补 DNA（cDNA）。之后 cDNA 可通过分子克隆、PCR 和测序等技术做进一步的研究。因此，反转录过程是许多 RNA 实验研究流程的关键步骤。为了获得更为准确的研究结果，本期总结了反转录过程中需要考虑的一些因素，以期能够抛砖引玉，给你的实验研究带来些许帮助。 本期内容RNA 模板制备基因组 DNA 的去除反转录酶选择引物选择主要反应组分反应温度和反应时间第一链和第二链 cDNA 合成注：本期内容较多，阅读完此文需要大概 8 分钟。 一、RNA 模板制备RNA 是反转录的模板。总 RNA 通常用于 RT-(q)PCR 等下游应用的 cDNA 合成，而特定类型的 RNA（如信使 RNA（mRNA）、miRNA 等小 RNA）可通过富集而用于某些实验应用，如 cDNA 文库构建和 miRNA 图谱分析。 保持 RNA 的完整性至关重要，在提取、处理、储存和实验过程中均需要采取特殊的保护措施。防止RNA降解的最佳方法包括佩戴手套、使用具有气溶胶屏障的移液器移液、使用无核酸酶的实验室器具和试剂以及对实验区域进行去污

一台 WB 成像系统可以同时拍摄化学发光和荧光信号，这个功能有什么用途呢？一篇 2014 年发表在 Cell Stem Cell 的文章为了研究硫巯基化如何影响信号通路，就需要在进行 Western Blot 时同时捕捉2种信号。蛋白质硫巯基化（S-sulfhydration, SHY）是一种依赖H2S的蛋白质翻译后修饰。H2S 作用于蛋白质的半胱氨酸残基，把巯基（-SH）转变为硫巯基（-SSH），改变蛋白空间结构，调控了蛋白的活性和功能。这篇文章主要研究硫化氢（H2S）调节 Ca2+ 通道硫巯基化，来维持间充质干细胞的功能和骨稳态。骨髓间充质干细胞产生H2S协助调节自我更新和成骨分化。H2S 缺乏会导致 Ca2+TRP 通道上多个半光氨酸残基的硫巯基化程度降低，产生钙内流异常。异常的钙内流会下调 PKC/Erk- 介导的 Wnt/β-catenin 信号，从而影响到成骨分化。结果提示通过无毒供体恢复 H2S 水平，可以治疗 H2S 缺乏导致的骨质疏松症等疾病。有趣的事情来了。在验证 H2S 通过 Ca2+ 通道的巯基化调节钙内流时，研究人员将 BMMSCs 分成了 2 组，一组使用

哺乳动物表达系统是适用于生成具有天然结构和活性的哺乳动物蛋白的首选表达平台，可以实现最高水平的翻译后加工，使蛋白质获得最佳功能活性，适合在最类似生理学的环境中研究特定蛋白质的功能。它常用于抗体和治疗性蛋白质以及人类功能细胞分析的蛋白质表达。和稳定表达相比，哺乳动物瞬时表达系统可实现灵活且快速的蛋白质生产，可以在 1-2 周内生成大量蛋白质，适用于人或其他哺乳动物蛋白的表达，和大肠杆菌、酵母或昆虫细胞等宿主表达系统相比，可实现更天然的折叠和翻译后修饰——包括糖基化（图 1）。图 1、哺乳动物蛋白表达系统的比较。低风险的蛋白表达系统助力科学研究对于蛋白表达来说，为特定应用选择合适的表达系统是成功的关键。在选择表达系统时，蛋白质溶解度、功能、纯化速度和产量通常是最重要的考虑因素。此外，每种系统均有其各自的优势和局限性，在选择表达系统时必须考虑，其中最常用的表达系统是 293 和 CHO 表达系统，根据表达的蛋白和研发阶段，选择最适合的表达系统至关重要。 文章来源：赛默飞世尔科技

某个实验间隙…萌新：开题报告已提交，转眼 1 个月过去了，实验还是一头雾水，为啥我的 co-IP 拉不下来蛋白？奋斗中的师兄：我当初正好相反，拉下来的蛋白被抗体条带覆盖住了，换个抗体忒不好找，无奈换了个蛋白，还好挺顺利。大师兄：蛋白吧，不但种类多，理化性质差异较大，关键它们又喜欢组队在细胞里干活，IP、co-IP 又是常用的手段，掌握好这个工具还是很重要的，总不能随随便便就换个蛋白。那要怎么快速掌握这项实验，轻松搞定各种疑难杂症呢？我们依据三十多年的 IP/co-IP 实验经验，总结了一线技术支持常被问到的问题，希望这篇纯干货能帮助大家顺利升级打怪，早日驾驭 IP、co-IP。IP、co-IP、pull-down 简介IP（Immunoprecipitation），免疫沉淀：是利用固定在磁珠或琼脂糖树脂等基质上的特异性抗体对抗原进行小型亲和纯化的一种方法Co-IP（co-Immunoprecipitation），免疫共沉淀： co-IP 是一种常用的鉴定蛋白-蛋白相互作用的方法，其基本实验流程和IP类似，通过使用诱饵蛋白（IP 中的抗原，bait protein）特异性抗体间接捕获与其

RNA 干扰（RNAi）是一种转录后基因沉默的机制。同时也是一项成熟的实验技术，它的出现彻底改变了研究人员研究哺乳动物基因表达的方式，并持续为如今的基因功能研究提供有价值的实验结果。RNAi 技术大大提高了在哺乳动物细胞和动物模型中进行基因功能缺失分析的便利性、速度和特异性，因此长期以来一直是深受研究人员信赖的一种选择。小干扰 RNA（siRNA）是 RNAi 技术中最为常用的一种手段，其在基础研究中已经发挥了巨大的作用。回到最基础的实验中，尽管已经非常成熟，想要顺利开展 siRNA 实验并拿到可靠的实验结果却不是那么容易的，除了选择高质量的稳定的siRNA 产品之外，还有很多实验设计和操作方面的注意事项。今天我们为大家总结了成功开展 siRNA 实验的十大秘诀。1.每个基因设计并测试两到四条 siRNA 序列为了找到一个潜在的靶点，分析感兴趣基因的全长寻找氨基酸序列。记录氨基酸和3′ 19核苷酸作为潜在的 siRNA 靶点。潜在的靶点随后通过对 GenBank 数据库的 BLAST 分析进行评估，去掉任何与其他基因有显著同源性的靶序列。如果可能的话，应该针对含有更少二级结构的靶 mR

生成全长转录组使用 Ambion 转录试剂盒合成的大多数 DNA 模板都可以生成全长转录组，无需任何优化。然而，一些模板可能产生过早终止的产物，如较小的离散带或拖尾/降解产物。对于印迹杂交，通常不需要全长 RNA 探针。然而，对于许多其他分析，至关重要的是转录进行到模板的末端，全部生成同一种大下的转录组（例如 NPA，体外翻译研究和结构分析）。转录反应失败或不良的两个最常见因素是标记核苷酸中的抑制剂和质量较差的 DNA 模板。应执行一系列简单的实验来确定转录反应失败的原因；随附的流程图概述了这一过程。以下列出了其他一些策略，用于增加有问题的转录反应中的全长产物比例。增加限制性核苷酸的浓度用最低浓度的标记核苷酸进行转录反应，可能由于核苷酸浓度不足而产生过早终止的转录组。增加限制性核苷酸的浓度通常会提高全长转录组的产量。降低反应的孵育温度通常，转录反应在室温或 37°C 下进行。将温度降低至约 16°C 或甚至 4°C 有时可以改善转录反应。人们认为，较低的反应温度会减慢聚合酶的进展，从而防止其被二级结构或一个特定核苷酸串置换。（想象一下玩具火车全速绕弯前行与缓慢绕同一条路线前行。）使用不

PCR 酶数量如此之多，选择正确的酶可能是一项挑战。用于扩增 DNA 的各种酶的保真性、扩增速度和特异性各不相同。以下三个问题可以帮助您解答选择 PCR 酶时需要重点关注的因素。Q 1：您需要确保序列准确性吗？有时您只需要检测 PCR 产物或估算其大小，例如在对小鼠进行基因分型或筛选重组克隆时。对于这种类型的常规 PCR 分析，您应该使用标准的热稳定 DNA 聚合酶（如 Taq DNA 聚合酶）来确认目的 DNA 存在与否。但是，如果要执行克隆实验或下一代测序（NGS），那么准确性至关重要。为了确保准确进行 DNA 拷贝，请确保选择高保真 DNA 聚合酶。高保真 PCR 酶具有 3'-5’ 核酸外切酶校对活性。当结合错误匹配的碱基对时，DNA 聚合酶停顿，导致合成暂延。合成暂延 允许去除错误匹配的核苷酸并使用正确的核苷酸取代。保持序列准确的 DNA 聚合酶的绝佳选择是 Invitrogen SuperFi 或 Thermo Scientific Phusion 高保真DNA聚合酶。这两种酶具有高保真度，准确度是 Taq DNA 聚合酶的 300 倍或 52 倍，并且具有很高的产率。Q

PCR 是众所周知的分子生物学技术之一。20 世纪 70 年代，研究人员首次报道了使用合成引物和 DNA 聚合酶从模板复制单链 DNA。然而直到 1983 年，Kary Mullis 才发明出用于扩增目标 DNA 的研究工具，就是我们今天所熟知的 PCR 方法。从此以后，PCR 成为分子生物学研究必不可少的一部分，被广泛应用于基础研究、疾病诊断、农业检测和法医调查等领域。1.基因表达通常可通过 PCR 来检测不同细胞类型、组织和生物体在特定时间点的基因表达差异。首先，从目标样品中分离出 RNA 并将mRNA逆转录成 cDNA。随后，通过由PCR扩增的cDNA数量，确定 mRNA 的初始水平。这一过程也被称为逆转录 PCR， RT-PCR （图 1）。图 1. RT-PCR.RNA 被逆转录成 cDNA，随后通过 PCR 扩增 cDNA终点 PCR 可通过凝胶里的扩增产物条带强度对 RNA 的表达进行定量（一种半定量方法）。例如，对起始 cDNA 进行连续稀释并扩增。通过凝胶电泳使不同起始量的终点 PCR 得率可视化（图 2），然后对条带强度进行定量，并以管家基因为参照进行标准化，预估扩

开篇之前先问个小问题您知道 PCR 的中文全称是什么吗？▼▼▼这是小编参加研究生面试时导师问的第一个问题，当时简直不敢相信自己的耳朵。如果您和我一样有片刻的犹豫，请备好小板凳，我们一起回顾一下简单 PCR 中那些需要我们了解的小知识。 PCR 基础知识PCR（Polymerase Chain Reaction），中文全称为聚合酶链式反应，是分子生物学研究中最为广泛应用的技术。在 70 年代的时候首次报道使用聚合酶及合成引物进行单链 DNA 的扩增，但直到 1983 年才正式作为一种研究工具用于 DNA 的扩增。自此以后，PCR 成为分子生物学研究不可缺少的一部分，被应用于从基础研究到疾病诊断、农业检测及法医调查等领域。其发明者 Kally Mullis 因此获得了 1993 年的诺贝尔化学奖。PCR 可在短时间内将单个 DNA 扩增得到成千上万个拷贝。其过程主要由 3 步组成：（1）变性，双链 DNA 经加热变成单链DNA；（2）退火，引物与模板的特异性结合；（3）延伸，DNA 聚合酶沿着模板，将引物的3’端延伸。 PCR 反应体系中的 6 大关键组分PCR 的成功取决于很多因素，其反

童鞋们都知道，要想成为真正的 PCR 达人，并非易事。一个小小的环节都可能让整个实验挂掉，也正是因此，PCR 成为了资深科研者们心中的痛。不要说实验本身，其实就连实验的耗材都隐藏着大学问，工欲善其事，必先利其器。今天我们就具体来说下 PCR 耗材中选择选择反应板的问题。PCR 板通常采用 96 孔和 384 孔的形式，其次为 24 孔和 48 孔。使用的 PCR 仪和正在进行的应用的性质将决定 PCR 板是否适合您的实验。裙边PCR 板的“裙”是板周围的板。裙边可为反应体系构建时的移液过程提供较好的稳定性，以及在进行自动机械处理时提供更好的机械强度。PCR 平板可分为无裙边，半裙边和全裙边。无裙边板缺少周围的面板（图 A）。这种形式的反应板可与绝大多数 PCR 仪和实时 PCR 仪的模块适配，但不适用于自动化应用。半裙边板在板的边缘周围具有短的边缘（图 B），在移液过程中提供足够的支撑，Applied Biosystems PCR 仪大多数均采用半裙边板。全裙边的 PCR 板具有覆盖板高度的边缘面板（图 C）。这种板形式适用于具有突出模块的 PCR 仪（可有利于自动化操作），可安全稳固

核酸电泳在许多分子生物学研究应用中都可用来检验实验结果，有时也可用于分离和纯化样品，以便进行后续应用。因此，常规核酸电泳的应用通常可以分为分析和制备两种类型，两者均依赖于分离、溶解和定量技术。 1.用于确认实验结果的分析型电泳在进入下一步工作流程或另一组实验之前，可使用分析型核酸电泳检验实验结果。正如下文所述，该方法主要针对凝胶中是否存在目标条带，以及条带的强度、迁移模式、迁移率和杂交情况进行评估。a. 检验酶促合成、消化和克隆实验是否成功核酸的电泳分析通常在以下技术（图 1）后立即进行以确定实验的成功和效率： 在几个小时内，聚合酶链式反应或 PCR 将目标序列的一个拷贝放大到数百万份拷贝。在终点 PCR 之后进行电泳，以确认靶标的扩增及其产量。在与限制酶反应以切割 DNA 底物上特定序列的限制消化反应后，在凝胶上运行的样品来确定 DNA 切割模式（以及消化完成的程度）。在分子克隆中，通过称为 连接的过程将 DNA 片段插入载体中。在一些情况下，可以在连接后进行电泳以评估反应效率（图 2）。然后将连接产物用于转化克隆生物体的 感受态细胞，如 大肠杆菌繁殖，然后筛选形成的菌落以确定它们是

凝胶电泳是许多分子生物学实验的重要部分。建立核酸电泳需采取一系列步骤来实现核酸样品的最佳分离和分析。核酸凝胶电泳工作流程1、选择和制备凝胶琼脂糖和聚丙烯酰胺是核酸分离中最常用的两种凝胶基质。两种材料都是三维基质，孔径大小适合核酸分离，且与样品间无反应。可通过改变基质的百分比来调整孔径大小，从而有效分离不同大小的核酸。有关琼脂糖凝胶和聚丙烯酰胺之间的选择，主要取决于核酸样品的大小和所希望达到的分辨率，虽然凝胶灌制和样品回收的方法也可考虑（表 1）。琼脂糖凝胶的孔径大小非常理想，可分离 0.1-25 kb 范围内的核酸分子。聚丙烯酰胺形成的孔径较小，可用于分离小于1 kb 的核酸分子。某些情况下，可采用聚丙烯酰胺凝胶以获得片段小于 100 bp 的单碱基分辨率[1]。表 1. 琼脂糖凝胶和聚丙烯酰胺凝胶之间的差异2. 准备标准品和样品a .核酸标准品选择当运行凝胶时，含有已知大小的核酸参照样品通常被称为标准品、标记或分子量标准，用于目的样品大小的估计。在为给定样品选择合适的分子量标准时，需考虑如下因素:Ladde 类型（例如 DNA 或 RNA），片段结构(例如单链或双链)，构象(例如超螺