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一、导论 质粒提取的原理:转自复旦大学一位老师的帖子后面是方法介绍 碱裂解法从大肠杆菌制备质粒是从事分子生物学研究的实验室每天都要用的常规技术。可是我收研究生十几年了几乎毫无例外的是我那些给人感觉什么都知道的优秀学生却对碱法质粒抽提的原理知之甚少。追其原因我想大概是因为《分子克隆》里面只讲实验操作步骤而没有对原理进行详细的论述。这是导致我的学生误入歧途的主要原因。后来我发现其实是整个 ...

重组DNA转化受体细胞后，须在不同水平上进行筛选，以区别转化子与非转化子、重组子与非重组子以及鉴定所需的特异性重组子。在转化过程中，并非每个受体细胞都被转化；即使获得转化细胞，也并非都含有目的基因，所以需采用有效方法进行筛选。筛选的方法包括根据遗传表型筛选、限制性内切酶分析筛选、核酸探针筛选、PCR筛选等。本实验采用遗传表型筛选中的抗生素平板筛选或α互补筛选的方法。 一、抗生素平板筛 ...

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目的基因与载体的重组（重组体的构建）程序如下： （1）质粒DNA 的分离纯化。一般含有单个目的基因的DNA 片段，即使进入了宿主细胞也不能进行增殖。通常它需要同适当的能自我复制的DNA 分子（例如质粒、噬菌体DNA 等）结合后，才能在通过转化或其他途径导入宿主细胞，像正常质粒或病毒一样增殖和易于检测。分离质粒载体DNA 有许多方法，但其共同步骤是先用溶菌酶处理含有质粒载体的宿主菌培养物，以除去其细 ...

基因的克隆就是利用体外重组技术，将特定的基因和其它DNA顺序插入到载体分子中。基因克隆的主要目标是识别、分离特异基因并获得基因的完整的全序列，确定染色体定位，阐明基因的生化功能，明确其对特定性状的遗传控制关系。通过几十年的努力由于植物发育，生理生化，分子遗传等学科的迅速发展，使人们掌握了大量有关植物优良性状基因的生物学和遗传学知识，再运用先进的酶学和生物学技术已经克隆出了与植物抗病、抗虫、抗除草剂 ...

试验原理: 大量提取的质粒DNA一般需进一步纯化常用柱层析法和氯化铯梯度离心法。常使用的所有纯化方法都利用了质粒DNA 相对较小及共价闭合环状这样两个性质。例如用氯化铯-溴化乙锭梯度平衡离心分离质粒和染色体DNA 就取决于溴化乙锭与线状以及与闭环DNA分子的结合量有所不同。 溴化乙锭通过嵌入碱基之间而与DNA结合进而使双螺旋解旋。由此导致线状DNA的长度有所增加作为补偿将在闭环质粒DNA中引入超螺 ...

DNA连接酶是1967年在三个实验室同时发现的。它是一种封闭DNA链上缺口酶借助ATP或NAD水解提供的能量催化DNA链的5'-PO4与另一DNA链的3'-OH生成磷酸二酯键。但这两条链必须是与同一条互补链配对结合的(T4DNA连接酶除外)而且必须是两条紧邻DNA链才能被DNA连接酶催化成磷酸二酯键。 常用的DNA连接酶有两种:来自大肠杆菌的DNA连接酶和来自噬菌体的T4DNA连接 ...

1.溶液I―溶菌液: 溶菌酶:它是糖苷水解酶能水解菌体细胞壁的主要化学成分肽聚糖中的β-14糖苷键因而具有溶菌的作用。当溶液中pH小于8时溶菌酶作用受到抑制。 葡萄糖:增加溶液的粘度维持渗透压防止DNA 受机械剪切力作用而降解。 EDTA:(1)螯合Mg2+、Ca2+等金属离子抑制脱氧核糖核酸酶对DNA 的降解作用(DNase作用时需要一定的金属离子作辅基);(2)EDTA的存在有利于溶 ...

简单序列长度多态性（simple sequence length polymorphism，SSLP）是据串联重复排列微卫星基序两侧的单一序列设计引物，对微卫星序列（microsatellite DNA 或simple sequence repeats，SSR）进行扩增，由微卫星基序重复数目的变异而产生多态性。由于中某一特定的微卫星的侧翼序列通常都是保守性较强的单一序列，因而可以将微卫星侧翼的DN ...

在非理想的条件下，内切酶切割与识别位点相似但不完全相同的序列，这一现象称星号活性。有人提出，这种"星号"活性可能是内切酶的一种普遍特性（1），如果提供给相应反应条件，所有内切酶都会出现非特异性切割。NEB已证实下列酶存在星号活性：Apo I（2）、Ase I（2）、BamH I（3）、BssH II（2）、EcoR I（4）、EcoR V（5）、Hind III（1）、Hinf ...

1、 感受态细胞的概念 重组DNA分子体外构建完成后，必须导入特定的宿主（受体）细胞，使之无性繁殖并高效表达外源基因或直接改变其遗传性状，这个导入过程及操作统称为重组DNA分子的转化。 在原核生物中，转化是一个较普遍的现象，在细胞间转化是否发生，一方面取决于供体菌与受体菌两者在进化过程中的亲缘关系，另一方面还与受体菌是否处于一种感受状态有着很大的关系。 所谓的感受态，即指受体（或者 ...

DNA的克隆是指在体外将含有目的基因或其它有意义的DNA片段同能够自我复制的载体DNA连接，然后将其转入宿主细胞或受体生物进行表达或进一步研究的分子操作的过程，因此DNA克隆又称分子克隆，基因操作或重组DNA技术。DNA克隆涉及一系列的分子生物学技术，如目的DNA片段的获得、载体的选择、各种工具酶的选用、体外重组、导入宿主细胞技术和重组子筛选技术等等。 一 目的DNA片段的获得 DNA克隆的第一步 ...

一．原理 ⑴ 5’-RACE法 ① 以目的mRNA 为模板，使用5’末端P 标记的RT 引物进行反转录反应，合成1ststrand cDNA。 ② 使用RNase H 分解 Hybrid DNA-RNA中的RNA链。 ③ 使用T4 RNA Ligase 使单链cDNA进行环化或形成首尾连接物。 ④ 进行PCR扩增。 图 4－2 5’-RACE 法原理 ⑵ 引物 ...

This procedure allows the concentration of DNA samples from dilute solution and the removal of unwanted salts from DNA samples. Materials •3M Sodium Acetate buffer pH 5.2 (store at 4 ℃) •Col ...

Dr. William H. Heidcamp Biology Department Gustavus Adolphus College http://homepages.gac.edu/~cellab/chpts/chpt14/ex14-6.html Materials •DNA •CsCl •0.3 N NaOH •0.2 M Tris-HCl buf ...

Equilibriation of Phenol Caution: Phenol and chlorofom are very toxic. Wear gloves protective eye wear and lab coat. Use hood. Phenol dissolves and denatures proteins. It dissolves protein that is ti ...

Hi This is my first post and I am desparately looking for some help recovering DNA from CsCl preps. I have recently run into some problems precipitating DNA using sodium acetate (3M 1:30 dilution) and ...

I'm looking for a methode to demethyle DNA in vivo during more than 5 days . All I've read about 5-aza-CdT is for maximum 5 days. Why ? Is there another drug and if yes how does it work ? thanks Elea ...

Description This method was suggested in a BRL "Focus" article several years ago (Zeugin & Hartley 1985). It is a useful way to avoid coprecipitation of proteins and accumulation of salt ...

Abstract: The “Freeze squeeze” method is a cost effective and technically simple procedure to isolate and prepare PCR products for DNA sequencing. Reagents •70% ethanol •3 M so ...