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TRANSFORMATION (ONE-STEP PEG METHOD) 1.Dilute 1:100 a fresh O/N culture of bacteria into prewarmed LB broth and incubate cells with shaking (225 rpm)to an OD600 of 0.3-0.4. 2.Add an equal volume of ic ...

Deproteination using phenol/chloroform (Maniatis et al.1982) 'Phenol' as used is Analar grade.Phenol should be melted at 65℃ 8-hydroxyquinoline added to a final concentration of 0.1%and equilibrated t ...

Use from 0.01 - 0.1 gram plant material. Grind the plant material with liq.N2 in a mortar.We normally use some alumina to crush hard tissue. Transfer the ground tissue to a eppendorf tube. Add 1 ml ex ...

Preparation of linear polyacrylamide used as carrier in ethanol precipitation of nucleic acids Linear polyacrylamide can be used as an efficient neutral carrier for precipitating nucleic acids with et ...

1、低温下长时间的连接效率比室温下短时间连接的好，平端连接需要过夜反应。 2、在体系中加一点切载体的酶，只要连接后原来的酶切位点消失。这样可避免载体自连，应该可以大大提高平端连接的效率。 足够多的载体和插入片段是最重要的 。要看片段具体情况而言，有时载体和片段浓度过高，容易产生线性化产物，不利于环化的。插入的DNA的摩尔数是载体摩尔数的5-10倍，这个很关键。载体通常50ng就够了，若载体在10k ...

Cepko/Tabin Lab Harvard University http://axon.med.harvard.edu/~cepko/protocol/mike/R1.html Protocol R.1 Random Prime Labeling of DNA Solutions Buffer A 1.25 M Tris 8.0 625 ml 2M Tris 8.0 2 125 ml 1M ...

hi thereI have been trying to clone 3.4 kb insert into pcDNA3.1- for months without any success.The insert is subcloned in TOPO from where I cut it out by KpnI and NotI and purify it by gelelectrophor ...

1.Crash Individual sand flies in 0.5 ml lysis buffer (50 mM NaCl 10 mM EDTA50 mM Tris-HCl pH 8).2.Incubate The sand fly homogenates with 100 ng/ml Rnase at 37 ℃ for 30 minutes. 3.Incubate The cell lys ...

Cepko/Tabin Lab Harvard University http://axon.med.harvard.edu/~cepko/protocol/mike/S6.html Superfrost plus slides and standard slides can be silinized but I have found that superfrost slides work be ...

A protocol / method / schedule /procedure for extraction / isolation of both DNA and RNA from the same material typically plant leaf / leaves (See also 1)Take one medium sized leaf or half a large lea ...

1.Add an equal volume (equal to sample volume)of P/C to sample. 2.Mix (shakedon't vortex). 3.Take aqueous (upper)layer.(If dirty samplerepeat Ph/Chl step until interface is fairly clean). 4.Add equal ...

hieverybody. i want extract DNA from cryopreserved clotted human blood.the smaple has been storaged 5 years in -20 degree. who is an expert on this topic . i need your help.i need the details. my emai ...

Hi! Would anyone out there be able to tell as to why alchohols like isopropanol or ethanol are used to precipitate nucleic acidsand alsowhy is the precipitation done at low temperatures ramesh -rames ...

1．感受态的制备 （1）接种单菌落于2ml LB培养液中，37℃过夜。 （2）取0.25ml过夜菌入25ml LB培养液中，37℃振摇4～6h至A590=0.4～0.6。 （3）倒入50ml管内，水浴10min，以2500～3000rpm离心5min，弃上清。 （4）缓慢加入75mmol/L预冷CaCl25ml悬浮菌体，冰浴20min，同上离心弃上清。 （5）缓慢加入75mmol/L预冷CaCl2 ...

该法是R.Treisman尚未发表的方法同时也是Brinboim和Doly(1979)及Ish-Horowicz和Burke(1981)所用方法的改进。该方法对于目前使用的所有大肠菌菌株都卓有成效并可与随后的纯化步骤如聚乙二醇沉淀或氯化铯-溴化乙锭梯度平衡离心等一并联合使用。注:括号中给出的体积可适用于未经氯霉素处理的培养。 试验准备: 1、溶液I:50mmol/L葡萄糖 25mmol/L Tr ...

Sanger双脱氧链终止法 Maxam－Gilbert DNA化学降解法 测序策略 目前应用的两种快速序列测定技术是Sanger等（1977）提出的酶法及Maxam和Gilbert(1977)提出的化学降解法。虽然其原理大相径庭，但这两种方法都是同样生成互相独立的若干组带放射性标记的寡核苷酸，每组寡核苷酸都有固定的起点，但却随机终止于特定的一种或者多种残基上。由于DNA上的每一个碱基出现在可变 ...

该法 可 ...

利用D NA 连接酶把载体 DNA 和要克隆的目的 DNA 片段连接在一起，成为一个完整的重组分子，这就是分子克隆中常说的连接反应。当载体 DNA 和外源 DNA 末端都是由一种产生粘性末端的内切酶切割产生的话（同尾酶也可以），或者两者末端被接上一段互补的多聚体的尾巴，那么经退火后可形成新的重组分子。连接后产生的重组分子中仍然保留着外源 DNA 两端的限制性内切酶切点 ，从而使我们能方便地从重组 ...

重组DNA技术涉及到组合不同来源的遗传信息，从而创造自然界以前可能从未存在过的遗传修饰生物体（genetically modified organisms，GMOs）。最初，在分子生物学家中有人担心这些生物体可能具有不可预测的不良性状，一旦从实验室逸出将带来生物学危害。这种担心在1975年美国加利福尼亚州阿西洛马市召开的科学会议上成为焦点。在那次会议上讨论了重组DNA技术的安全问题并提出了第一个重 ...

鉴定转基因植物的第一步就是要确定被转基因已经稳定的整合到了染色体上。第二步任务就是评估有多少个转基因拷贝，以及每个转基因的表达水平如何。一般经过上游表达载体的设计构建以及下游转化体系的建立、转化品系的筛选鉴定等一系列步骤后，即获得 T 0 代转基因植物。在转化过程中，外源 DNA 随机插入植物内，插入的拷贝数和位点都不固定。插入外源基因的拷贝数低（1或2个）能较好的表达，插入的拷贝数多则会导致表达 ...