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ziputao：真核表达载体转染细胞后必须要筛选吗？如G418，不筛，直接做指标检测行吗，谢大侠指教！ 丁香园网友yangea认为： 不一定，这是瞬时转染与稳定转染的区别。只要对所转入的基因能“可视”，达到检测的目的即可（如构建的载体连接有报告基因的情况）。按照转入目的基因的不同，瞬时转染可在12-72小时有表达，根据表达的峰值时间检测指标就可以了。 ...

ouyangty247：战友们有没有人正在做MMP-2和MMP-9的RT-PCR的？ 我正在做，做得头都大了还没做出来，还请多多交流！ 丁香园网友clearair00认为： 有什么问题能说的具体一些吗？大家帮你一起讨论，顺便也可以让后做类似实验的园友们少走些弯路，一举多得，岂不快哉！ 丁香园网友ouyangty247认为： 我是从文献上直接查的引物，cDNA合成的GAPDH能出来，条带还挺宽挺亮， ...

ouyangty247：我正在做rt-pcr，奇怪的是，我用的同一支RNA，同时逆转录好几管，所有的东西都是预混好再分装的。 PCR时，除cDNA外所有的东西也都是预混好再分装的，引物用的是GAPDH，再分别加入先前RT得到的cDNA，按理说不应该都是一样的么？可是跑胶后却发现有的有条带，有的就没有。做了好几次都是这样，为什么？？？太奇怪了！ 我做的头都大了，不知道到底是哪出了问题，恳请大家多多帮 ...

baichangming：核型分析图片处理问题 在核型分析中照出来的图片上，染色体地分布都是杂乱无章的，但是发表在刊物上的图片有的有排列的很好，这是怎么弄得呢？（如下图） 丁香园网友xudangood认为： 给核型排除，“整型”是要用到专业的核型分析软件的，比如ISIS　5.0等，在版内搜下应该有介绍。很多医学和大学也会提供这样的服务。 如果是想自己弄，不严格作为投稿的 ...

xuewanmei：用作基因芯片检测的细胞用什么试剂保存？ 我现在要分选细胞，送到公司里去做基因芯片检测，请问这些细胞应该用什么保存？ 我打算分选出来的细胞先放-80℃，等到分选出足够的量时再送到公司里去做检测！ 丁香园网友clearair00认为： 是做cDNA芯片吗？如果这样，最好是保存于RNA提取试剂如TRIZoL中后短期内（1month）置-80℃。 ...

amenrenren：为什么筛选了半个月后荧光变得很弱呢? 转染pEGFP-目的基因后36小时候加G418一天就死了百分之78十所以从第二天起就把浓度减半了，又筛了将近十天了，发现留下的基本有荧光，但都比较弱。我分析是G418浓度太低了所致，以至于只要表达甚少就可以生存了。 所以我打算在加大浓度一下大家认为是什么原因呢？ 帮我出出注意，荧光太弱到后面会不会就没了，太担心了 丁香园网友caprico ...

jw52317：细胞转染后的筛选，如何配制培养液？ 最近打算将一cDNA转染到一肿瘤细胞内，所用的质粒（pCMV）只有氨苄西林的抗性基因（Amp），请问有哪位朋友知道我转染细胞后该怎么配制筛选培养液，包括选用的抗生素，浓度已经转染后什么时候开始筛选的等。 丁香园网友学山肥虎认为： 1 质粒的概念 质粒（plasmid）是独立于染色体外、具有自主复制能力的遗传单位，其本质是较小的核酸分子，大小范围在 ...

tjmedwnn：确定G418最佳筛选浓度用什么细胞？ 大家好，我现在做实验，用G418抗性的逆转录病毒包装系统收获病毒液做稳定转染，第一步需要用PT67细胞包装收获病毒液，说明书上说质粒转入PT67细胞后要用G418做筛选，之前需要用不同浓度的G418做一个最佳筛选浓度试验。请教大家，用来做确定最佳浓度试验的PT67细胞是用未经过任何处理的PT67细胞呢还是用已经转染过的PT67细胞？？ 另外收 ...

kissdana：我用pEGFPC3真核表达载体用lipofectamine2000来转染3T3L1细胞，结果转染率特别低，请问那位同仁用过类似的方法转染过这个细胞？能否给些建议？多谢了 丁香园网友yushulin认为： 这个细胞转染的效率是很低，没太多好办法，试着换一下实际，我们用罗氏的HD转染效率比lipofectamine2000高一点，但是也不是很高。 ...

tjmedwnn：关于G418筛选的问题 大家好，请问我用G418筛选转染细胞，首先做最佳浓度确定实验，为什么要取5天杀死大量细胞，14天杀死全部细胞的最小量，我的问题是，为什么取5天，而不是3天或4天2天的，WHY？ 做最佳浓度确定实验加药时的细胞数有规定吗，是不是种多种少没什么区别？我感觉书上说的接种数量是不是太少了？细胞数目多对筛选有影响吗？ 丁香园网友DXY721认为： 细胞加了G418后 ...

tjmedwnn：请问25uM的氯喹是这样配的吗？？？？ 大家好，我做质粒转染，说明书上说转染前要加25uM的氯喹。我买的氯喹分子量是515.86，请问大家如果换算成质量这怎么计算啊，是不是25/515.86=0.048μg然后称取0.048μg加进去啊，请大家多教教我，谢谢！ 丁香园网友szcsyan认为： 一般配成stock，浓度高一点。比如25mM。用的时候再稀释。 看你买的是多 ...

feiniao2005038：测序本人拿菌液让生工测序，结果是双峰，是什么意思？怎么回事？重组的质粒用酶切鉴定没有问题， 丁香园网友zhaochengling认为： 1.有可能是基因重复，重复的两个拷贝之间有一个硷基的差异 样品本身被污染，这常常发生在样品为质粒和菌液的情况中。当使用通用引物测序时，如果刚好和样品中的几个质粒均能结合，那么就会出现这种情况，而且在同一位置上还可能有不止两个峰形； 2 ...

jc_484190：咨询3β-HSD的染色配方 请问有谁做过3β-HSD的染色啊？这种染色的配方是什么啊？南京的同学有没有在做得啊？ 丁香园网友jfeiharry认为： 刚刚baidu了一下，看了一点相关资料，希望对你有些帮助 3β-HSDH反应溶液 脱氢表雄酮（DHEA）10mmol溶于丙酮0.5ml 尼克酰胺（1.6mg/ml）1.0ml 硝基蓝四唑（NBT）（1 ...

问：请问提取细胞RNA的方法？答：细胞总RNA的提取：1、6孔板细胞汇合度为90-100%时，取出无菌室，去其上清，用PBS洗两次后，每孔加TRIZOL试剂 1 ml，摇匀，无菌罩内消化3-5 min。2、将各孔内消化好的细胞裂解液吸到一DEPC处理过的1.5 ml EP管中，加新开的氯仿0.2 ml，轻摇15 s。3、室温静置2-3 min后，12000 rpm，15 min，4 ℃，离心。然后 ...

flybaker：请教有关胰腺石蜡切片制作方法的问题 按照普通石蜡切片的制作流程做出的大鼠胰腺组织切片，能被染上的细胞很少，而且细胞间的空隙很大。我自己分析可能是由于胰腺厚薄不均，导致透明时间没掌握好，透明过度组织变脆。再加上胰腺形状不规则，切片时没切到整个面。不知道有没有人做过胰腺的石蜡切片，和普通组织的石蜡切片制作方法相比有没有什么需要特别注意的？？ 丁香园网友zgxsea认为： 是正常的大鼠 ...

phoolishkate：脂质体转染后必须用不含抗生素的培养基吗？ 我的培养基都加了青链霉素，转染后是不是不能用？ 丁香园网友applezph认为： 由于脂质体转染对细胞存在一定毒性，一般说来转染前的一次传代就应用不含抗生素的培养基，转染后的话我觉得也不应该加青链（我都是这么做的） 当然如果对自己的操作实在没有把握的话，我认为你可以考虑试试转染后加，但不要太早，4-6小时换液用无抗生素的，可以24 ...

p猫：稳定转染之后的细胞为什么荧光强度会有很大的不同？ 在建立稳定株的整个过程中都存在这个问题，理论上说同一个细胞克隆出来的细胞团里面的每个细胞表达蛋白的水平应该是一样的吧，可是为什么荧光显微镜下看荧光强度差异却很大呢？这样的稳定株能用来做后续的实验吗？ 丁香园网友lhczj认为： 如果不考虑荧光强度，细胞能够长时间保持有荧光，可以继续实验 我周围很多做稳定转染的也有这种情况 丁香园网友dtlxj ...

zy_dalian：请问Lipofectamine2000使用高手：转染后多久加药物? 加LIPO2000后，我选择4小时后换培养基. 那大家是换液后多久加药进行研究的呢?（根据自己研究的不同，药物是不同的）； 先谢谢啦！ 丁香园网友silentjill认为： 说明书上不是说的48-72小时后就可以了么？ 丁香园网友出来混的认为： 我是根据转的效率加药的 丁香园网友applezph认为： 一般Li ...

多年来我国病原微生物实验室包括临床实验室的生物安全防护问题一直未能得到足够的重视。2003年上半年爆发流行的SARS和最近有可能从实验室传播出去的SARS病例引起了社会的普遍关注。为了加强对病原微生物实验室的管理，防止从实验室传播传染性疾病，国务院正在草拟《病原微生物实验室安全管理条例》，将实验室的安全管理提升到依法管理的层面上。因此，临床实验室如何加强生物安全防护就成为我们急待解决的问题。 世界 ...

guoguoloo：彗星试验电泳前的细胞应该用什么方法保存 最近要做大鼠脑组织细胞和血淋巴细胞的彗星试验。因为取完组织细胞后不能立刻跑电泳，请问脑组织该如何保存，4度，-20度，-80度或液氮？ 丁香园网友hjhj4604认为： 比较麻烦，冷冻或低温都会对细胞造成DNA损伤，影响结果。 建议现取现做，实在不行暂放４度，时间不可过长。 丁香园网友djhmily认为： 请问，我把细胞收集了（PBS离心 ...