全部

在目前的以HRP作为标记酶的商品ELISA试剂盒中，如以TMB为底物，则提供的底物为A和B两瓶应用液；如以OPD为底物，则试剂盒提供OPD片剂或粉剂，临用前配制。一般商品试剂盒显色反应条件为37℃或室温反应15~30min。从理论上说，37℃30min才可以使HRP的底物催化反应完全，尽管在最初的10min内，绝大部分催化反应即可完成。因此，为使弱阳性样本孔能有充分的显色，建议在37℃下反应25~30min后，终止反应比色测定。

提取样品的总RNA后，一般根据RNA的凝胶电泳图来判断RNA的质量。由于RNA容易形成二级结构，因此常用甲醛变性胶来进行RNA电泳，得到的电泳图能真实反映RNA的质量状况。

细胞中有大约30%的蛋白质是膜蛋白，不过人们现在还不是很清楚这些膜蛋白的原子结构。到目前为止，在PDB（Protein Data Bank）的结构数据库中只有不到1%的资料是膜蛋白的结构数据。这不是说膜蛋白的结构不重要，相反，膜受体蛋白非常重要，它们是大部分药物的作用靶点。但由于一直缺乏很好的膜蛋白大量可溶性表达技术，因此也就得不到足够的蛋白结晶体用于结构分析。即使是结构基因组学（文后小词典）这项旨在分析每一个蛋白家族结构的学科，也因为存在技术难题而没有将研究重点放在膜蛋白上。现在，经过传统结构生物学家和结构基因组学家的不懈努力，蛋白表达、溶解和结晶这一系列的技术瓶颈都得到了突破，并且已经出现了部分成果。

由于血液中的红细胞没有细胞核，用于基因表达分析时，往往是分析血液中白细胞的基因表达情况。因此首先需要把血液中的白细胞进行分离。下面方法是我们实验室摸索的适合基因芯片技术白细胞分离的过程。

用于基因芯片分析的细胞RNA的抽提:细胞培养结束后，若是贴壁细胞，可以用移液器吸去培养基，并加入3ml左右的PBS洗一次（需要注意的是从冰箱中取出的PBS缓冲液温度要尽量回复到室温，避免给细胞冷的刺激）。吸去PBS后，即可加入适量的Trizol试剂，Trizol的量一般是每10cm2的面积加1ml的Trizol；若是悬浮细胞，可以进行离心，吸去上层的培养液，加入适量的Trizol，一般是5-10×106细胞加1ml的Trizol。加入Trizol后，用移液器反复吹打细胞，使细胞充分裂解（见图1-图3）。判断Trizol加量是否合适的标准可以根据细胞溶解物的粘度来判断。在细胞刚溶解时，可以发现有丝状物出现，这是细胞的基因组DNA释放出来了，若Trizol量合适，吹打几次后，丝状物会消失，液体粘稠性下降；若Trizol量过少，丝状物往往一直存在，液体粘稠性大，可以继续补加Trizol。若Trizol的量过少，会导致抽提的RNA中有较多的基因组DNA污染。由于Trizol试剂中含有强烈的RNA酶抑制剂，因此细胞充分溶解在Trizol中后就不用担心RNA的降。

哺乳动物组织样品RNA的抽提最基本的要素是防止RNA在抽提过程中降解，以及尽可能得到最高的RNA抽提效率。以下介绍我们实验室认为最符合以上两个要素的抽提方法。

（1）取3 g样品，加入10% 样品重的多聚聚乙烯吡咯烷酮（PVPP），用液氮研磨成细粉状，将细粉分为每份约3 g，并贮藏于-80℃下。（2）在5O ml falcon管中加入2O ml提取缓冲液。提取液的组成为0.2 mol/L 脱水四硼酸钠（sodium tetriborate decahydrate）、30 mmol/L 乙二胺四乙酸（EDTA）、1% （W/V）十二烷基硫酸钠（SDS）、 ...

从植物组织中提取RNA是进行植物分子生物学方面研究的必要前提。要进行Northern杂交分析，纯化mRNA以用于体外翻译或建立cDNA文库，RT-PCR及差示分析等分子生物学研究，都需要高质量的RNA。因此，从植物组织中提取纯度高、完整性好的RNA是顺利进行上述研究的关键所在。

一、准备试剂：氯仿，异丙醇，75℅乙醇，无RNase的水或0.5℅SDS（溶液均需用DEPC处理过的水配制）。二、操作步骤：1. 匀浆处理：a. 组织 将组织在液氮中磨碎，每50-100mg组织加入1ml TRIzol，用匀浆仪进行匀浆处理。样品体积不应超过TRIzol体积10℅。b. 单层培养细胞 直接在培养板中加入TRIzol裂解细胞，每10cm2面积（即3.5cm直径的培养板）加1 ...

一、操作注意事项： 由于RNA酶的广泛存在与难以灭活的顽固特性。使得RNA的提取纯化和后续工作变得非常困难。为了保证RNA的研究工作成功，请仔细阅读下列注意事项，相信它能帮助您解决常见的问题。 归根究底，RNA工作的主要问题是防止RNA酶的污染。RNA酶无处不在，在实验操作的任何一步，任何偶然的疏忽或不当操作都有可能造成RNA酶污染，从而导致整个实验失败。因此，严格控制实验条件，避免任何可能的污染 ...

采用McCormick（1991）等的方法，具体步骤如下： 1、将0.25g面粉置入预先称重10ml离心管，加5ml蒸馏水，混匀； 2、先70℃晃动水浴10 min，再移至100℃水浴10 min； 3、冷水冷却5 min后，1700g离心4min，小心吸去上清液，称重； 4、膨胀势=/ 面粉重（g） ...

用澳大利亚Newport Science Corp.公司的快速粘度仪（Rapid Visco Analyzer，RVA）测定面粉的糊化温度、峰值时间以及高峰粘度、低谷粘度、松懈值、最后粘度和反弹值等粘度参数。

淀粉一般都是直链淀粉和支链淀粉的混合物。直链淀粉和支链淀粉含量和比例因植物种类而不同，决定着谷物种子的出饭率和食味品质，并影响着谷物的贮藏加工。通过本实验学习掌握双波长测定谷物中直链淀粉和支链淀粉的含量。

RT-PCR步骤:一、总RNA提取1. 取200mg组织，放到1.5mlEP管中，加入1mlTrizol剪碎。2. 震荡30s。3. 加0.2ml氯仿，剧烈摇动30s，室温3min。4. 12000×g，4℃离心，15min。5. 吸上层无色水相，移入另一EP管中（约0.5ml）。6. 加等体积异丙醇，-20℃，30min。7. 12000×g，4℃离心，10min。在管底部可 ...

GSH和GSSG 参照 Anderson等 （1992）。取0.5 g样品，加入3 mL冰冷的6%的偏磷酸（含1 mmol•L-1 EDTA ， pH 2.8），冰浴研磨，匀浆液以20,000 g，4 ℃离心15 min，取上清液来马上测定GSH和GSSG的含量或储存在-20 ℃下等待测定。总的GSH和GSSG含量测定如下：200 μL提取液加 1.2 mL反应液包含400 μL反应液1（110 mmol•L-1 Na2HPO4•7H20， 40 mmol•L-1 NaH2PO4•H2O， 15 mmol•L-1EDTA， 0.3 mmol•L-1 5,5‘-dithiobis-（2-nitrobenzoic acid） DTNB， 0.04% BSA）、320 μL反应液2 （1 mmol•L-1 EDTA， 50 mmol•L-1 imidazole 咪唑solution and 0.02% BSA）、 400 μL反应液3（5% Na2HPO4， pH 7.5的溶液稀释50倍）、80 μL 9.0 mmol•L-1 NADPH。测定OD412下的吸收值。GSSG含量测定如下：20

1. 探针的标记：（1） 如下设置探针标记的反应体系：待标记探针 （1.75pmol/微升） 2微升T4 Polynucleotide Kinase Buffer （10X） 1微升nuclease-Free Water 5微升ATP（3，000Ci/mmol at 10mCi/ml） 1微升T4 Polynucleotide Kinase （5-10u/微升） 1微升总体积 10 ...

甲醛变性电泳检测RNA完整性：在250mL的锥形瓶中准确称量2g Agarose （Sigama），再加20mL 10×TAE Buffer，144mLDEPC处理过的双蒸水，微波炉中化胶，待冷却至50-60℃加EB至终浓度≤0.5μg/mL。在通风橱中加入36 mL甲醛，放置一段时间以减少甲醛蒸汽。

核酸分子（DNA或RNA）由于含有嘌吟环和嘧啶环的共轭双键，在260 nm波长处有特异的紫外吸收峰，其吸收强度与核酸的浓度成正比，这个物理特性为测定核酸溶液浓度提供了基础。1 OD260相当于dsDNA 50 ug/ml，ssDNA 33 ug/ml和ssRNA 40 ug/ml。可以此来计算核酸样品的浓度。

三氯甲烷，无色透明易挥发液体，有特殊的香甜气味。沸点：61.2℃，蒸汽密度：4.36。用作制冷剂R22和工程塑料的制造。医药上用作麻醉剂。也用作萃取剂和溶剂。有很强的麻醉作用，在光的作用下，能被空气中的氧反应生成氯化氢和剧毒的光气。通常加入1—2%乙醇，使生成的光气与乙醇作用而生成碳酸乙酯，以消除其毒性。

四氯甲烷，无色透明易挥发液体，有特殊气味。沸点：76.8℃，密度：1.59。用作制冷剂和喷气发动机燃料氟隆气的原料。还用作萃取剂、溶剂、干洗剂、脱漆剂、灭火剂熏蒸剂、杀虫剂以及氯化剂。本品为毒害品。有轻度的麻醉作用，对心脏、肝、肾有严重的损害。