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Period基因（第三部分）

Period基因

VHCDR3基因文库和VL基因的扩增：设计并合成含有CDR3随机化序列的VHFOR引物。 配制2个50ul PCR反应混合液，1个用于VH基因的扩增。

PCR剪接VHCDR3基因文库和VL基因构建scFv基因文库：用于连接scFv和pHENl DNA以及将scFv文库电转化到大肠杆菌TGl株的试剂和设备FDSEQ引物。

构建人VH基因节段文库：配制3个各自独立的50ul PCR反应混合液，包含……在有加热盖的热循环仪内加热反应物到94℃，5分钟……在1.5%琼脂糖胶上胶纯化VH基因文库并用Genecleall试剂盒提取DNA.

再扩增VH基因文库添加3‘限制性位点并克隆创建VH基因节段文库：用于连接scFv和pHENl DNA以及将scFv文库电转化到大肠杆菌的试剂和设备。

创建重链改组噬菌体文库：配制50ul PCR反应混合液，包含：Vent聚合酶缓冲液，VentDNA聚合酶。

人VL基因文库的构建：器材和试剂：PCR试剂和设备，cFv基因文库单链模板DNA,制备自pHENl中的天然scFv文库（10ng/u1），Gelleclean试剂盒。

创建轻链改组噬菌体文库：PCR试剂和设备，含有起始scFV基因的载体pHENl单链模板DNA。

平衡法选择高亲和力噬菌体抗体：器材和试剂:链霉亲和素磁珠,磁性1.5ml试管架。

筛选解离速率优化的scFv：选择3~5轮后，随机挑取克隆加入96孔微量滴定板中 并诱导表达可溶性scFv.然后，在包被有相关抗原的96孔微量滴定板中，用ELISA分析含有可溶性scFv的细菌上清。

原位免疫PCR的IHC增敏方法：Sano等（1992）率先利用基因工程的方法表达了A蛋白与链霉亲和素的嵌合体分子获得成功，建立了免疫PCR技术。这是一种新的抗原检测系统，利用细胞工程和基因工程技术，巧妙地将抗原抗体反应的特异性同PCR的敏感性相结合，通过构建单克隆抗体与重组核酸的嵌合体分子，使得利用PCR技术检测蛋白成为可能。

滚动式循环放大法IHC增敏方法：滚动式循环放大（RCA）法是一种能够在恒温条件下，使标记有寡核苷酸探针（与组织细胞内的核苷酸无相关性）的抗体（特异性一抗或第二抗）与组织细胞内的抗原结合后，在DNA聚合酶的作用下，加入的寡核苷酸进行循环扩增，产生一条扩增的DNA序列拷贝产物。

白磷还原法制备胶体金分散颗粒：胶体金可用多种方法制备，其中应用较为广泛的是化学还原法。这一方法的基本原理是在氯化金水溶液中加入一定量的还原剂，使金离子还原为金原子，可用于制备胶体金的还原剂有50余种，但在生物医学领域内最为常用的还原剂是白磷、柠檬酸三钠以及鞣酸等。

制备胶体金分散颗粒的其他方法：乙醇-超声波还原法（Baigent和Muller,1980），硼氢化钠还原法（Tschopp等，1982），放射性胶体金制备法（Kent等，1981）

当蛋白质的最适稳定量及标记的最佳pH值被确定以后，便可进行标记。具体步骤如下：（1）根据标记所用胶体金的总量计算出所需要待标记蛋白质的总量。

胶体金标记蛋白质的纯化:标记好的免疫金探针必须经过纯化处理才能用于IHC染色，尤其是免疫电镜的染色。纯化的目的就是除去其中未标记的蛋白质，未充分标记的胶体金及在标记过程可能形成的各种聚合物。其纯化方法有超速离心法、色谱柱法以及以上二者相结合应用。

本法是由Geoghegan等（1978）首次应用金标探针检测B淋巴细胞表面抗原，将胶体金颗粒（大于20nm）标记在第二抗体或SPA分子上，制备成金标二抗。

免疫金银染色（IGSS）操作流程：做冰冻切片的组织可先经过固定再作切片，也可先制作冰冻切片，然后再固定。这要根据保存抗原的需要而定，固定过的组织可用含20%蔗糖的PBS（0.1mol/L,pH7.4）浸泡过夜，使切片减少冰结晶，保持组织细胞良好的形态结构。

免疫金银染色方法敏感、简便、省时、安全可靠，葡萄球菌A蛋白（SPA）金标记四步法是在此基础上发展起来的更为敏感的一种新方法。SPA和许多哺乳类动物IgG具有亲和性，且它们之间的连接不会干扰抗原-抗体的结合。