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蛋白质组学研究策略 与基因组学相比，蛋白质组学的技术平台尚不完善，需不断优化和完善现有的平台，并建立与发展新的平台。目前尚没有合适的方法能一步实现对复杂蛋白质混合物的定性和定量分析，还必须把分离、鉴定、定量以及数据处理手段进行整合。文献报道的蛋白质组学研究策略多种多样，但是主要有两种路线：第一种是传统的二维凝胶电泳分离、胶内酶解与质谱技术鉴定相结合的方法，这也是目前最常用的一种路线；第二种 ...

二维凝胶电泳质谱技术等电聚焦电泳 1. IPG的pH值范围 等电聚焦电泳(isoelectrofocusing，IEF)目前广泛使用商品化的IPG胶条。其pH值范围的选择一般遵循以下原则：①pH 3一10线性梯度胶适于了解样本中所有蛋白质的分布情况；②pH 3―10非线性梯度胶能提高pH 5―7之间的样本蛋白质解析度；③联合使用pH 4～7和pH 6～11梯度胶可获得相关pH范围的更 ...

十二烷基硫酸钠―聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS―PAGE) 第二相聚丙烯酰胺凝胶的选择主要取决于需要分离蛋白质的相对分子质量的范围，这与单相的聚丙烯酰胺凝胶电泳的选择是相同的。当蛋白质相对分子质量在15 000～200 000时，电泳迁移率与相对分子质量的对数呈线性关系。SDS―PAGE不仅可分离蛋白质，且可在一定范围内粗略测定蛋白质的相对分子质量。其主要步骤如下。 (1)凝胶配制及灌 ...

二维凝胶电泳质谱技术蛋白质样品的制备 选择正确的样品制备方法是双相电泳实验成功的关键，根据实验设计和研究目的而选择不同的蛋白质样品制备方法。 1．蛋白质样品制备过程中须遵循的基本原则 蛋白质样品制备过程中须遵循的基本原则：①可以重复溶解包括疏水性蛋白质在内的所有蛋白质；②在等电聚焦电泳过程中，避免溶解性低的蛋白质聚积和析出；③减少蛋白质的化学修饰或蛋白质降解；④去除核酸、多糖和 ...

蛋白质胶内酶解 从二维凝胶电泳到基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱技术(MALDI―TOF―MS)需要有一个胶后处理系统，包括凝胶的图像扫描和分析、蛋白质斑点切割、酶解和MALDI靶上点样等步骤，其自动化程度的高低是蛋白质组研究能否达到高通量、高灵敏度和高准确性的关键步骤之一。 快速银染的蛋白质点进行胶上酶解的主要步骤如下。 (1)清洗和脱色：将蛋白质点用Ettan切胶仪(A ...

蛋白质点的鉴定 以质谱技术为基础的蛋白质鉴定技术，由于其灵敏度高(可以达到皮摩尔)、速度快、易实现自动化已经成为蛋白质组研究中主要的蛋白质鉴定技术。将胶上蛋白质点进行蛋白酶切、回收酶切肽段后，采用MALDI―TOF―MS测定肽质量指纹谱(peptide mapping fingerprint，PMF)，或采用电喷雾串联质谱(ESI―MS―MS)测定肽序列，分别进行数据库检索，实现蛋白质的鉴 ...

凝胶蛋白检测技术 理想的检测方法必须具有以下特点：①良好的线性范围，即染色强度与蛋白质量成正比；②良好的通用性，即对不同蛋白质具有相同的染色能力；③良好的兼容性，检测后不影响后续的鉴定过程，即不影响蛋白质或多肽在质谱仪中的离子化过程；④高灵敏度，检测出尽量多的低拷贝蛋白；⑤高稳定性和重复性。但目前仍无完全符合上述条件的检测方法。考马斯亮蓝染色、银染等各种传统显色技术对于蛋白质组学高灵敏度、 ...

二维凝胶电泳质谱技术图像分析 目前主要的二维凝胶电泳专业图像分析软件有BIO―RAD公司的PDQuest 6．0、Amersham Pharmacia Biotech的Image Master 2D Elite和Genomic Solutions开发的Biolmage 2D Investigator等。Image Master 2DElite的操作界面较好，简便易学，且可处理各种来源的ti ...

蛋白质组学与医学研究 蛋白质组研究技术已应用到生命科学各个领域。在基础研究方面如生物学、神经生物学等，涉及各种重要的生物学现象，如信号传导、细胞分化、蛋白质折叠等。在应用研究方面，蛋白质组学重点研究人类重大疾病的发病机制、早期诊断及治疗，致病微生物的致病机制、耐药性及发现新的抗生素等。此处所指的人类重大疾病包括癌症(肝癌、乳腺癌、鼻咽癌、膀胱癌、肺癌、直肠癌等)、心血管疾病(心肌梗死、冠心 ...

条件性基因敲除与敲入 在生理学研究中，为了明确某一组织或器官的功能，常将实验动物体内所要研究的组织或器官切除，进而根据实验动物的生理指标或功能的变化来推测切除部分的功能。生命科学发展到今天，人们对于生命现象的认识已经逐步深入到了分子水平，而上述的“部分切除―观察整体―推测功能”的研究思想仍然有效。具体地说，就是在分子水平破坏想要研究的基因，然后观察生物体的生理指标、功能、整体形态、组织结构 ...

条件性基因敲除的基本原理Flp／FRT系统 该系统与Cre／loxP系统相同，也是由一个重组酶和一段特殊的DNA序列组成。从进化的角度上考虑，Flp／FRT系统是Cre／loxP系统在真核细胞内的同源系统。其中．重组酶Flp是酵母细胞内的一个由423个氨基酸组成的单体蛋白。与Cre相似，Flp发挥作用也不需要任何辅助因子，同时在不同的条件下具有良好的稳定性。该系统的另一个成分Flp识别位点 ...

loxP转基因动物的构建 loxP转基因动物是在基因组中待修饰基因区域的两侧各插入了1个loxP位点的转基因动物。该转基因动物的构建首先需要一种特殊的载体，这种载体主要由3个部分组成：①分别存在于打靶载体5，和3’臂端，是与靶基因一定区域相同的同源序列，其作用是介导打靶载体与靶基因之间的同源重组。②位于5’和3’臂端之间有待敲除的靶基因区段序列或有待敲人的外源序列和选择标志基因。选择标志基 ...

条件性基因敲除的基本原理Cre／loxP重组系统 条件性基因敲除主要是通过Cre／10xP或者Ftp／FRT重组系统来实现的。这两个系统都是位点特异性重组酶系统，已发展成为在体内、外进行遗传操作的有力工具。这两个系统的应用，可以使靶基因的表达或缺失发生在试验动物发育的某一阶段或某一特定的组织器官。此外，若与控制Cre或Flp表达的其他诱导系统相结合，还可以对某一基因同时实现时空两方面的调控 ...

胚胎干细胞的囊胚注射法构建Cre转基因动物 先将Cre时空特异表达载体线性化，之后用电穿孔等方法将其导人胚胎干细胞中，并以同源重组的方式整合进胚胎干细胞的基因组。这种经过遗传改造的胚胎干细胞再被注入囊胚，最后将胚胎植入假孕母鼠的子宫，使其发育成为一个个体。囊胚注射法的具体步骤如下。胚胎干细胞囊胚注射法构建Cre转基因小鼠示意图 (1)选择合适的载体，将Cre重组酶的编码基因与其重 ...

受精卵雄性原核显微注射法构建Cre转基因动物 Cre转基因动物即时空特异性表达重组酶Cre的转基因动物。构建此动物的目的在于为loxP转基因动物提供重组酶Cre。由于在该转基因动物中Cre的表达被置于特异性启动子的调控之下，因此它会以组织细胞特异性和发育阶段特异性的方式向loxP转基因动物提供Cre重组酶，以便在特定的发育阶段、特定的组织细胞中使两个loxP之间的区域缺失。当然，实现此目标 ...

基于Cre/loxP系统建立的四环素诱导条件性基因敲除系统 该系统包含两个互补系统，分别为tTA依赖和rtTA依赖的基因敲除系统，现在又被称为Tet―Off(tTA依赖)系统和Tet―On(rtTA依赖)系统。在这两个系统中，四环素控制转录因子tTA或rtTA与启动子Ptec的结合，从而调节下游基因的表达。所不同的是tTA与启动子Ptet的结合是不需要四环素的，四环素阻碍两者之间的相互作用 ...

条件性基因敲除的策略 条件性基因敲人是在特定的时期、特定的组织和器官中使某个基因获得表达，可用于研究致病基因的功能或者构建在特定的条件下、特定的组织和器官中表达某个基因的转基因动物模型。其基本原理和实施方法与前面介绍的条件性基因敲人非常相似，只不过在构建loxP转基因动物时，靶基因与启动子之间含有一段具有翻译终止密码的基因序列，导致靶基因不能正常翻译。而这段分割序列的两侧各有一个loxP位 ...

条件性基因敲除应用于研究基因的功能 层粘连蛋白(Laminin)是细胞外基质中的一个重要成分，在调节细胞的生长和功能方面发挥重要的作用。层粘连蛋白是一个异源三聚体，由α、β和γ亚基构成。之前的研究表明，层粘连蛋白功能的缺陷可以导致肌肉营养失调和外周神经髓鞘形成障碍。全身性层粘连蛋白基因的缺失可以导致胚胎在胚胎发育第5天即发生死亡，因此用传统的基因缺失方法无法研究层粘连蛋白基因在外周神经系统 ...

致病基因的条件性敲入，构律人类某些疾病的动物模型 利用Cre／loxP系统进行条件性基因敲人的原理与基因敲除的原理非常相似，区别只是在事先想要研究的基因编码区内引入一段翻译终止序列，并且该终止序列的两侧具有两个同向的loxP位点。在没有Cre重组酶的组织和器官中，由于翻译终止序列存在致病基因是没有活性的，在某些特定的组织器官中，当Cre重组酶出现时会导致终止序列的丢失，从而使致病基因激活， ...

条件性基因敲除应用于追踪细胞的发育命运 在胚胎发育过程中，特定器官的出现以及特定类型细胞的分化是按照细胞内的程序有条不紊地进行的，研究这些细胞的分化及迁移，对于阐明个体的发生过程、探讨某些疾病的发生机制非常重要。在研究过程中，一般会选择一种或多种特定细胞的分子标志来标记相应细胞的分化、运动以及形态的变化。但是检测这些分子标志的一般方法如RT-PCR或原位杂交等不能提供连续、动态的报告，而基 ...