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        十二烷基硫酸钠―聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS―PAGE)

        互联网

        9122
        十二烷基硫酸钠―聚丙烯酰胺凝胶电泳 (SDS ― PAGE)

        第二相聚丙烯胺 胺凝胶的选择主要取决于需要分离蛋白质的相对分子质量的范围,这与单相的聚丙烯酰胺凝胶电泳的选择是相同的。当蛋白质相对分子质量在15 000~200 000时,电泳迁移率与相对分子质量的对数呈线性关系。SDS―PAGE不仅可分离蛋白质,且可在一定范围内粗略测定蛋白质的相对分子质量。其主要步骤如下。

        (1)凝胶配制及灌胶:胶浓度越高,所分离蛋白质的相对分子质量范围也越大。薄的胶,其染色和脱色快,且背景染色浅;厚的胶则上样量大,但不易碎。

        (2)第一相胶条的平衡:平衡的目的是让一相IPG胶条更好地适应二相SDS―PAGE的电泳环境,防止电内渗(electroendosmosis)以及提高蛋白质向第二相的转移效率。平衡母液基本组成:Tris(50 mmol/l pH 6.8)+Urea(6 mol/L)+甘油(30%)+SDS(2%)。

        平衡一般分两步,每步不超过15min。第一步平衡母液中加入1%DTT,使蛋白质保持还原状态;第二步平衡母液中加入2.5%碘乙酰胺,使蛋白质烷化,防止电泳时蛋白质再氧化。

        (3)第一相胶条的转移:需注意IPG胶条放人二相凝胶后,胶条的侧面及与二相凝胶间不能有气泡,以利蛋白质的转移。

        (4)电泳:初始电压为分离电压的一半,初始电泳时间不能过短,以保证大分子量蛋白质也完全转入二相凝胶。

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