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基因组非特异性甲基化水平的研究 1．3H―SAM掺入后液闪检测法 (1)将约2ug基因组与足量3H标记的SAM，甲基化酶(Sss工或HpaⅡ)共同温育，SAM的甲基化基团将被掺人到目的DNA中未甲基化的胞嘧啶上。 (2)以WhatmanDE81滤纸过滤此温育混合物，并以液闪缓冲液淋洗去掉未结合的3H标记的SAM，以液闪检测该滤纸上结合的’H标记的SAM量。如此值较高，则提示原来 ...

限制性酶及PCR的方法 此法将MSRE和PCR技术的结合，大大提高了检测DNA甲基化的灵敏度。该法基于DNA经MSRE切割后，位于限制性位点侧翼的特异性引物仅能有效扩增那些甲基化而免于切割的DNA片段，但不能扩增未甲基化且遭受切割的DNA片段。本法定性只需0．6ngDNA，定量检测仅需50ngDNA，检出下限(指某一方法能检测到甲基化等位基因的拷贝数在整个DNA分子中所占的最小比例)约降低 ...

结合亚硫酸氢钠处理和酶解分析(COBRA) 亚硫酸氢钠处理的DNA扩增后使甲基化的胞嘧啶残基成为胸腺嘧啶，而已经甲基化的胞嘧啶残基仍维持胞嘧啶。这种变化会产生新的酶切位点或保持原有的甲基化依赖位点。PCR反应的引物中不包含CpG二核苷酸，因此与模板和原来的甲基化位点不会混淆。在此之后，将PCR产物纯化、酶切、聚丙烯酰胺凝胶电泳、电印迹、单核苷酸杂交和磷图像定量。 COBRA是一个测 ...

亚硫酸氢钠测序法(bisulfite genomic sequencing) 直接测序法是建立在MSP基础上进一步深入研究CpG岛各个位点甲基化情况的方法。重亚硫酸盐使DNA中未发生甲基化的胞嘧啶脱氨基转变成尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶保持不变，行PCR扩增(引物设计时尽量避免有CpG，以免受甲基化因素的影响)所需片段，则尿嘧啶全部转化成胸腺嘧啶。最后，对PCR产物进行测序，并且与未经处理的序列 ...

酶的区域性甲基化特异性分析(ERMA) 酶的区域性甲基化分析是一种定量区域性CpG甲基化密度研究方法。基因组DNA在亚硫酸氢钠处理后，感兴趣的区域由包含dam位点的引物扩增。扩增后的PCR产物与14C标记的SAM及dam甲基转移酶温育，作为标准DNA定量的内参照。之后将3H标记的SAM和M．SssI甲基转移酶温育。在每个检测中使用具有确定甲基化位点细胞系DNA的标准混合物，每个样品的3H／ ...

甲基化敏感的单核苷酸的扩增(Ms―SnuPE) Ms―SnuPE即甲基化特异的单核苷酸扩增，它能对不同甲基化特异位点进行快速定量，是一种快速估计特异性CpG位点甲基化不同情况的定量方法。 先用重亚硫酸盐处理基因组DNA，未甲基化的胞嘧啶全部转化为尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶不变。进行PCR扩增，然后取等量扩增产物置于2管中，分别作为Ms―SnuPE单核苷酸引物延伸的模板。设计用于Ms― ...

组蛋白乙酰化的研究方法 1．HAT活性的测定 HAT可以催化放射性标记的乙酰辅酶A掺人核心组蛋白(有的选用H4氨基末端的14个氨基酸短肽)底物，然后测定掺人的放射性强度可以确定HAT的活性。HAT的活性单位定义为30~C时，将1pmol醋酸在10rain内掺人小牛胸腺组蛋白所需的酶量。 2．HDAC活性的分析 HDAC活性的检测比较烦琐。 3．染色质免疫沉淀技术 ...

甲基化荧光PCR检测 甲基化荧光检测(methylight)是利用荧光定量性PCR检测亚硫酸氢钠处理后的序列改变。在TaqManR技术中，可以使用3种不同的单核苷酸(正义引物、反义引物和荧光杂交探针)，进行不同序列的检测。与已存在的技术相比，甲基化荧光检测最明显的优点就是能同时对几百甚至几千例样品迅速检测。 高敏感、快速是本方法最显著的特点，它可以在非甲基化等位基因超出10 ...

DNA甲基化在肿瘤诊断中应用 表观遗传学吸引入的地方就是在肿瘤的早期检测中的应用，因为研究表明表观遗传的变化伴随肿瘤的发生与发展，使用表观遗传学方法可以有助于肿瘤的早期发现。现在肿瘤表观遗传治疗的主要研究方向包括DNA甲基转移酶和组蛋白去乙酰化酶抑制剂的研制及靶向诱导DNA甲基化等。 癌症的早期发现对癌症患者的有效治疗是非常重要的。目前对癌症的诊断主要依据临床症状、图像信号检测和组织 ...

受体的分类与功能受体是细胞表面或亚细胞组分的一类生物大分子，可以特异性识别，并与有生物活性的化学信号物质(配体)结合，从而激活或启动一系列生物化学反应，最后导致该信号物质特定的生物效应。受体主要有两方面的功能：一是识别特异的信号物质一配体，与之结合；二是把识别和接受的信号准确无误地放大并传递到细胞内，启动一系列细胞内信号级联反应，最后导致特定的细胞生物学效应。要使细胞间的信号转换为细胞内 ...

细胞信号转导的概念 生物体是有一群具有特殊结构与功能的细胞组成的复杂有机体，生物物种的繁衍，遗传特性的保持，以及生物个体的发生、发展，机体各部分之间和生物体内外环境的统一等所有生命活动，都是在细胞信息传递和调控下进行的。因此多细胞生物对外界的刺激(包括物理、化学、生物因素)，需要细胞间复杂的信号转导系统来传递，从而调控机体内每个功能各异细胞的新陈代谢和行为，以保证整个生命活动的正常进行。细 ...

DNA甲基化抑制剂和HDAC在肿瘤治疗中的应用 目前发现一些胞嘧啶类似物可以抑制DNMT活性，例如5―氮杂胞嘧啶核苷和它的脱氧类似物5―氮杂―2―脱氧胞嘧啶核苷，它们可以有效地抑制DNA甲基转移酶。通过在DNA复制过程中取代胞嘧啶及与DNMT，形成共价键后抑制DNMT的活性及抑制DNA甲基化，被广泛应用于研究DNA甲基化的生物过程和治疗急性粒细胞白血病。但这两种药物在水溶液中不稳定，且有毒 ...

ERK信号转导通路 在MAPK家族中，ERK是最先被发现并被了解最多的成员。ERK包括了两种异构体ERKl和ERK2(分别为P44和P42)。两个磷酸化受体位点即酪氨酸和苏氨酸被谷氨酸残基分隔开来，故其磷酸化位点基序是TEY。目前认为，P38和JNK属于“应激诱导”的MAPK，而ERK被认为是与细胞增殖、转化和分化相关的MAPK。 ERK级联反应包括典型的3个层次MAPKs的序贯激活 ...

细胞凋亡信号途径 细胞凋亡本质上是一种程序性细胞死亡，是机体在生理或病理条件下，启动自身内部机制，经过多途径的信号传递，结束其自身生命的过程。细胞凋亡具有特征性的形态学及生物化学改变。凋亡早期主要表现为胞质空泡，染色质浓缩并沿核膜排列；凋亡细胞与细胞外基质或周围细胞分离。随着凋亡过程的进展，胞质空泡与胞膜融合，导致膜发泡，随后空泡与细胞分离，引起水分丢失，细胞皱缩，同时染色质进行性固缩，并 ...

JNK信号转导通路 研究发现，用紫外线照射细胞后，一种蛋白激酶能够磷酸化f―jun，其磷酸化位点位于c―jun氨基末端活性区Set63和Ser73，该蛋白激酶被称为c―jun氨基末端激酶(c―jun N―terminal kinase，JNK)。JNK原来被称为应激激活的蛋白激酶(SAPK)。与其他MAPK一样，当酪氨酸和苏氨酸残基发生磷酸化后，JNK／SAPK也可被激活。JNK可以受各种 ...

PI3K―Akt信号通路 PI3K是一个复杂的大家族，根据其结构可分为3类：I型、Ⅱ型、Ⅲ型。 I型PI3K又分为IA和IB两个亚型，他们分别从酪氨酸激酶连接受体和G蛋白连接受体传递信号，其作用是催化磷脂酰肌醇(P1)在D3位的磷酸化，把底物PIP2转化为PIP3。IA型P13K是由催化亚单位Pll0和调节亚单位P85所组成的二聚体蛋白，具有类脂激酶和蛋白激酶的双重活性。在正常细胞中，P ...

P38MAPK信号转导通路 分裂原激活的蛋白激酶(mitogen activated protein kinases，MAPK)家族是非常保守的丝氨酸／苏氨酸蛋白激酶，是信号转导过程中一组主要的信号分子，在发育和疾病发生过程中起重要作用。该家族有4个成员，即细胞外信号调节激酶(extracellular regulated proteinhnase l／2，ERK 1／2)，c―jun N ...

Ras信号通路 很多生长因子如EGF、PDGF、FGF等激活受体酪氨酸激酶后，通过中介分子可活化由原癌基因FaS编码的Ras蛋白，后者能进一步催化其底物蛋白的酪氨酸磷酸化反应，并引发蛋白磷酸化的级联反应，最终导致细胞的增殖效应。由于Ras蛋白为多种生长因子信号转导过程所共有，故把此信号转导途径称为Ras通路。 Ras蛋白是癌基因las的编码产物，人类有3种ras基因，即H―FaS、K ...

激光扫描共焦显微镜的应用 激光扫描共焦显微镜(confocal laser scanning microscopy，CLSM)在传统荧光显微镜成像的基础上加装了激光扫描装置，利用紫外或可见激光激发荧光探针，对生物样品进行断层扫描，结合计算机对荧光图像进行加工处理，观察细胞和组织内部各个层面或不同侧面的形态变化。激光扫描共焦显微镜集激光技术、电子技术、光学设计及计算机于一体，它的优势为具有更 ...

免疫组织化学-体内原位检测信号分子表达变化 免疫组织化学染色是引入附有标记物的外源性抗体(或抗原)，使之锚定于组织或细胞标本中相应的抗原(或抗体)部位，标记物经呈色反应而显示代检抗原(或抗体)，因此，免疫组织化学可按标记物的种类以及定位方法分类。按标记物分为免疫荧光法、免疫酶法、免疫金银法、放射免疫自显影法等；按定位方法则分为一步法(又称直接法)、二步法(包括间接法、夹心法、补体法)和多步 ...