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以PVDF膜为固相载体的半干转印法

间接免疫印迹检测的方法【准备工作】 在准备做抗原检测时，须考虑所用一抗和二抗的最佳浓度，对不同来源的抗体，其特异性抗体的浓度都不相同。因此，对一抗体进行滴定有助于确定最佳反应比例，预先滴定二抗对实验也有帮助，一旦确定最佳浓度，则每次印迹即可用同一批一抗、二抗来完成。多数情况下可采用商家提供的浓度进行检测。【材料与试剂】（1） PBS：称取8g NaCl；0.2g KCl ...

免疫检测主要取决于抗原抗体的特异性，特别是能够识别膜上变性的和固定化抗原的抗体。因印迹膜上有非特异性吸附蛋白质的位点，因此需进行封闭以防免疫试剂的非特异性吸附。将印迹膜与一定浓度的不参与特异性反应蛋白质或去污剂溶液孵育可实现封闭。然后通过抗体与膜上抗原的特异性结合来定位抗原。抗原可用易观察的标记的抗体进行检测。抗体本身可以标记，直接用于检测抗原，但更为常见的是，使用的抗 ...

用荧光素标记抗体，下面介绍直接法和半透膜法。

免疫荧光标记技术 免疫标记技术（immunolabelling techniques）是使用荧光素、酶、放射性核素、铁蛋白、胶体金及化学（或生物）发光剂等作为示踪物，对抗原或抗体标记后进行的抗原抗体反应；并借助于荧光显微镜、酶标检测仪、射线测定仪等精密仪器，对实验结果直接镜检观察或进行自动化测定，可以在细胞、亚细胞及分子水平上，对抗原抗体反应进行定性或定位研究；或应用各种液相和固相免疫分析 ...

本底高和非特异性条带可能是由于抗体制剂中存在与印迹膜上其它蛋白质结合的抗体（非特异性抗体）。对于免疫印迹来说，理想的抗体应是仅能特异性识别待测抗原，但实情并非如此，印迹膜上总会出现一些额外的条带。这些条带的来源一般有两种：一种是由于制剂中存在的非特异性抗体产生的背景条带，另一种则是由于特异性抗体与含有与待测抗原类似表位的多肽发生的交叉反应。 动物抗血清中含有 ...

对于化学发光检测系统和多数抗体制剂来说，检测最低值可达到约2 fmol/L（10-15）的水平。相当于0.1ng 的50 000kD的蛋白质，高于此浓度的样品较易检出。一个标准的SDS �聚丙烯酰胺凝胶泳道的上样量为150µg（小胶道可为15µg），如果上样量过大条带会发生扭曲变形。因此，50kD中等大小蛋白抗原的上样量以0.1ng/150µg（或1/15 000 0 ...

影响免疫印迹的抗体的性质与待检测蛋白质的含量 影响免疫印迹成败的一个主要因素是抗原分子中可被抗体识别的表位的性质。只有那些能识别耐变性表位的抗体可与抗原结合。多数多克隆抗血清中或多或少地含有这种类型的抗体，所以在免疫印迹实验中常选用多克隆抗体。相反，许多单克隆抗体不能与变性抗原反应，因为它识别的表位依赖于抗原蛋白正确折叠所形成的三维空间构象。表显示各种抗体的优缺点。抗体的选择 多克隆 ...

时间分辨荧光免疫分析（以血清中T3和T4检测为例） 时间分辨荧光免疫分析（time resolved luoro-immunoassay，TrFIA）技术出现于20世纪80年代初期，是在免疫荧光分析的基础上发展的一种新型超微量物质免疫分析方法。TrFIA采用镧系稀土元素标记抗体，利用荧光发射体的荧光寿命差别将波长相同的荧光分开，排除样品中的非特异荧光的干扰，从而最大限度地提高分析方法的灵敏 ...

经典的荧光抗体技术基本原理(1)直接法直接法是荧光抗体技术最简单、最基本的方法。它通过标记抗体直接与相应抗原（待检抗原标本）结合，来鉴定未知抗原。其优点为：①由于在反应中只有两种因子参与，结果判断较简单；②特异性强，与其他抗原交叉染色较少；③操作步骤少，方法简便、省时。其缺点有；①敏感性较差；②一种标记抗体只能鉴定一种抗原；③不能用于鉴定未知抗体。(2)间接法间接法是目前最常用的方法。首先用已 ...

细胞表面抗原的检测-间接免疫荧光法【试剂】（1）一抗和荧光标记的二抗（2）固定液：如4%多聚甲醛、乙醇等。（3）洗涤液及抗体稀释液(pH 7.4 PBS-Tween 20)【操作方法】（1）取已固定好的细胞爬片或甩片或经过预处理的组织切片（石蜡或冰冻切片）；（2）加入25ml一抗，完全盖住盖玻片，室温孵育60min；注意不可使盖玻片接触培养板孔边缘。每个检测应包括3组对照：与一抗同一种属、类型 ...

细胞内抗原的检测-间接免疫荧光法 细胞内抗原的检测过程与细胞表面抗原检测过程基本一致，只是在与一抗孵育前，需要预先对细胞用非离子去污剂进行透化处理。【操作方法】（1）取已固定好的细胞爬片或甩片或经过预处理的组织切片（石蜡或冰冻切片）；（2）用含0.2%TritonX-100或NP-40的PBS溶液透化固定后的细胞2min（室温），有些标本可能需要长达15min，时间视抗原而定；（3）余下步 ...

荧光抗体的质量鉴定与保存 荧光抗体的质量通常用抗体效价和结合比率（F/P比值）来表示。1、抗体效价：一般用琼脂双向扩散法测定。中央孔内加抗原（1 mg/ml），抗体稀释度在1:16-1:32呈阳性者较为理想。2、荧光素（F）与蛋白质（P）结合比率（F/P比值）法 F/P比值系指荧光素与抗体蛋白的克分子比值，是标记抗体质量鉴定的重要指标之一。该比值以1-2（抗球蛋白荧光抗体）或略高于2（ ...

荧光偏振免疫分析（以环孢霉素检测为例）【基本原理】 荧光偏振免疫分析（FPIA）是一种利用物质分子在溶液中旋转速度与分子量大小呈反比的特点，定量检测抗原或抗体的一种分析方法。Ag或荧光标记的Ag（AgF）旋转比Ag-Ab或AgF-Ab复合物快，当接受一个偏振光面的投入时，如AgF分子的长轴与投入的偏振光面平行，荧光物吸收的偏振光最多，分子呈激发态，当回到基态时发射一个偏振光。如果反应液中的 ...

酶标抗体的制备试剂及配制（1）辣根过氧化物酶（HRP）（2）抗体：要求见上节“荧光抗体的制备”（3）交联剂：戊二醛，过碘酸钠（4）0.05mol/L， PH9.5碳酸盐缓冲液(CBS) NaHCO3 2.94g Na2CO3 1.59g 蒸馏水加至 1000ml（5）1.0mol/L， pH9.5 ...

酶标抗体的质量鉴定与保存1． 酶活性和抗体效价测定 采用双向免疫扩散法（稀释抗体）和DAB-H2O2显色反应检测结合物中抗体效价和免疫沉淀线中的酶促反应。2． 酶量和IgG量 酶量（mg/ml）=OD403´0.4 IgG量（mg/ml）=（OD280-OD402´0.42）´0.94´0.62 其中，0.42为酶蛋白本身（0.3）及结合戊二醛后增加的OD值，0.94为抗体 ...

改良过碘酸钠标记法制备酶标抗体 HRP分子中与酶活性无关的糖基被过碘酸钠氧化为醛基，再与抗体蛋白的氨基形成Schiff碱。为了防止酶蛋白的氨基与醛基发生自身偶联，在标记前先用2，4-二硝基氟苯(DNFB)封闭酶蛋白中残留的a-和e-氨基。酶与抗体的结合反应后，再加入硼氢化钠还原成稳定的结合物。(1) 取HRP 5mg溶于0.2mol/L，pH5.6醋酸盐缓冲液1ml中，加入1%DNFB无 ...

酶-抗酶复合物的制备 1970年Sternberger等首先报道PAP法，也称为非标记抗体酶法（unlabelled antibody enzyme method）。此法不用任何化学交联剂处理酶和抗体，二者活性不受化学反应的改变和损伤，从而可使免疫酶法的灵敏度大为提高，常用于ELISA和免疫组织化学染色。 PAP制备的基本原理：抗体与相应抗原在一定条件下发生沉淀反应，但当抗原过量 ...

戊二醛二步交联法制备酶标抗体 戊二醛（glutaraldehyde，GA）：是一种常用的同型双功能交联剂，它的两个醛基可分别与HRP和抗体蛋白的氨基形成Schiff碱（-N=C-），将他们以五碳桥连接起来。戊二醛连接反应是最温和的交联反应之一。可在4-40℃范围，pH6.0-8.0的缓冲液中进行。另外，GA缩合体使被结合的蛋白分子与分子之间的间隔延长，可免于使蛋白分子的三级结构发生改变。 ...

过氧化物酶-抗过氧化物酶复合物的制备【试剂及配制】(1) HRP和兔（或羊）抗HRP：抗HRP用HRP免疫兔（或羊）获得，方法见附注。(2) 0.075mol/L醋酸钠-0.15 mol/L醋酸铵等量混合液(3) 0.1mol/LHCl和0.01mol/LHCl(4) 饱和硫酸铵溶液(5) 0.01mol/L NaOH【操作方法】(1) 取兔（或羊）抗HRP血清5ml，16000r/min离 ...