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        间接免疫印迹检测的方法

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        【准备工作】

        在准备做抗原检测时,须考虑所用一抗和二抗的最佳浓度,对不同来源的抗体,其特异性抗体的浓度都不相同。因此,对一抗体进行滴定有助于确定最佳反应比例,预先滴定二抗对实验也有帮助,一旦确定最佳浓度,则每次印迹即可用同一批一抗、二抗来完成。多数情况下可采用商家提供的浓度进行检测。

        【材料与试剂】

        (1) PBS:称取8g NaCl;0.2g KCl;1.44g Na2 HPO4 和0.24g KH2 PO4 ,加蒸馏水800ml,用HCl调节溶液pH值至7.4,加水至1L,在1.034?105 Pa高压下蒸气灭菌20min,室温保存。

        (2) 封闭液(见表3-3)。

        (3) 1%BSA/PBS

        (4) 一抗试剂和碱性磷酸酶或辣根过氧化物酶标记的二抗试剂(通常是用辣根过氧化物酶标记的抗免疫球蛋白抗体)。

        (5) 碱性磷酸酶底物溶液:

        ① NBT(氮蓝四唑)溶液:在10ml 70%的二甲基甲酰胺中溶解0.5g NTB;

        ② BCIP(5-溴-4-氮-3-吲哚磷酸)溶液:在10ml 70%的二甲基甲酰胺中溶解0.5g BCIP;

        ③ 碱性磷酸酶缓冲液:100mmol/L NaCl;5mmol/L MgCl2 ;100mmol/L Tris-HCl (pH9.5),置密闭容器中保存,此溶液稳定;

        ④ 取66μl NBT溶液与10ml碱性磷酸酶缓冲液混匀,加入33lμlBCIP溶液。

        (6) 辣根过氧化物酶底物溶液:用9ml的0.01mol/L Tris-Cl (pH 7.6)溶液中溶解6mg3-3′―二氨基联苯胺,加入1ml 0.3%(w/v)NiCl2 或CoCl2 ,用Whatman1号滤纸过滤以除去沉淀,加入10μl 30%H2 O2 混匀后立即使用。此溶液须在临用时配制。

        【操作方法】

        (1) 用PBS漂洗印迹膜数次;

        (2) 加入一种封闭液(见表3-3)。注意:不同的抗原和实验方法需用不同的封闭缓冲液。例如,BSA(V部分)和牛奶都含有磷酸化的酪氨酸和生物素,用特异性抗磷酸化酪氨酸抗体进行实验时,这会给解释实验结果造成一定的混淆,也给亲合素/链霉亲合素检测的应用带来一些问题。某些牛奶制品可抑制碱性磷酸酶的活性。若无信号或检测背景较高,则需尝试不同的封闭缓冲液;

        (3) 室温下搅动孵育。一般孵育20min~2h或4℃过夜较好;

        (4) 从封闭缓冲液中取出印迹膜,用PBS漂洗3次,每次5min;

        (5) 加入工作浓度的一抗溶液。每张15×15cm的印迹膜用量为10ml。所有的稀释液均用含有蛋白质的溶液,例如1%BSA/PBS。孵育可在浅盘或塑料袋中进行。在室温下将抗体和印迹膜搅动孵育至少1h。有人认为4℃孵育过夜(12~18h)可提高灵敏度;

        (6) 用PBS漂洗印迹膜4次,每次换液洗5min;

        (7) 此时,印迹膜便可加入工作浓度的标记的二抗溶液。可在浅盘或塑料袋中室温孵育1h。抗体用含有蛋白质的溶液进行稀释,例如1%BSA/PBS。商品化的酶标二抗应在5~0.5μg/ml浓度之间使用(通常将商品试剂原液稀释成1:200~1:2000的应用液)。用辣根过氧化物酶标记的试剂须用不含叠氮钠的封闭液稀释;

        (8) 用PBS漂洗印迹膜4次,每次换液洗5min;

        (9) 将经漂洗的印迹膜移至另一干净浅盘中,按印迹膜面积加入0.1ml/cm2 的底物溶液(若使用碱性磷酸酶标记的二抗,用碱性磷酸酶底物溶液,若用辣根过氧化物酶标记的二抗则用辣根过氧化物酶底物溶液),于室温轻轻摇动,待蛋白条带的颜色深度达到要求(约2~20min),用水略为漂洗,放入PBS中;

        (10) 拍摄照片,留作永久实验记录(过氧化物酶染色的蛋白条带经日光照射数小时后颜色将退去)。

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