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免疫亲和层析的操作方案一、免疫亲和层析程序方案概述 免疫亲和层析可分为三个步骤：（1）将抗体与基质（微珠）共价交联并制备抗体亲和层析柱。（2）将抗原结合到抗体-微珠基质上。（3）抗原的洗脱。 第一步，先将单克隆抗体或经过亲和层析纯化的多克隆抗体以共价方式交联到固相基质（微珠）上。除特殊情况外，一般不使用未经纯化的多抗，因为从多抗层析柱上洗脱抗原非常困难，通常需要以适当的条件先使抗原变 ...

基因工程抗体活性及亲和力的测定 基因工程抗体活性的测定方法主要采用免疫学的常规手段，如免疫荧光技术，免疫酶技术，放射免疫分析技术(RIA)等。表达的抗体片段如Fv、ScFv、VH等缺少完整抗体的恒定区即Fc段，常规ELISA方法中酶标二抗无法与之直接反应，制备可变区的抗体方法又非常复杂和困难，因此，主要采用免疫竞争抑制法，即通过抗体如ScFv与相应McAb对抗原结合的竞争抑制，间接 ...

常用交联剂交联剂化学名同源或异源双功能反应基团蛋白结合基团光激活性间隔臂长(A)DMA二甲基二亚胺酯同源亚胺酯-NH2N8.6DMP二甲基亚胺酯同源亚胺酯-NH2N9.2DMS二甲基苯二酸亚胺酯同源亚胺酯-NH2N11DSG琥珀酸辛二酸戊二酸盐同源N-羟基琥珀酰亚胺-NH2N7.7DSS琥珀酸辛二酸二亚胺同源N-羟基琥珀酰亚胺-NH2N11.4BMH马来酰亚胺己烷同源马来酰亚胺-SH2NMBS ...

常用的活性微珠，活化微珠的交联交联机制蛋白质上的结合基团 最终交联的稳定性推荐基质商品举例羰基二咪唑-NH2避免pH10琼脂糖珠交联琼脂糖珠聚丙烯酰胺CM Bio-Gel A Gel(Bio-Rad)ECH Sepharose 4B(Pharmacia)Reacti-Gel 6X(Pierce Chemical)Reacti-Gel GF-2000(Pierce Chemical)溴 ...

活化微珠交联的常见问题与解决方法 虽然将抗体有效地与活性微珠交联是一项简单的工作，主要问题是要保持抗体的活性。抗体失活大多是由于抗体与微珠过度交联，或交联发生在抗体的抗原结合片段，使与微珠交联的抗体结合抗原的能力显著低于未交联的抗体。通常能够保持l0~50％抗体活性，这可认为是活性良好水平。在交联过程中，如果抗体的活性远远低于这一水平，可采取下列三种措施保持抗体活性。 （1）在彻 ...

抗体-蛋白A或-蛋白G微珠层析柱的制备 蛋白A或蛋白G微珠-抗体层析柱是免疫亲和层析技术中最常用的微珠基质之一。此类层析柱容易制备，由于抗体分子是通过Fc段与微珠基质结合，抗原结合片段（Fab）可与抗原最大限度地发生作用。以下介绍的方法可用于蛋白质抗原的纯化，但类似的方案也适用于任何其他抗原。 抗体可直接与蛋白A或蛋白G结合。根据抗体与蛋白A或蛋白G的亲和力，可以选用蛋白A或蛋白G微 ...

抗原与抗体-微珠基质的结合 虽然使抗原有效地结合到免疫亲和柱上的方法很多，因为抗体是通过共价键交联在微珠上，而不是游离于溶液中，所以交联在微珠上的抗体与抗原结合所需的时间比抗体和抗原二者以游离状态在溶液中所需的时间要长得多，因此，选用的方法应使抗原与交联的抗体达到最大程度的结合。推荐使用两种结合方法：将抗原溶液加入呈糊状的抗体-微珠内，不断混和均匀；或将抗原溶液流经抗体-微珠层析柱，保持抗 ...

抗原结合到抗体-微珠基质层析柱上 为了将抗原结合到抗体微珠基质上，最简单方法是将微珠装到一个层析柱内，再将抗原溶液流经层析柱，当抗原流经层析柱时结合到抗体上而被固定，直到洗脱时才洗脱下来。这种方法的效率取决于抗原与固定的抗体之间的接触时间，通过控制流速，可以改变抗原抗体之间的作用时间。【准备工作】 开始前，要考虑层析柱的类型和尺寸。一般来说，粗而矮的柱子比细而高的柱子容易获得陡峭的 ...

在混悬液中结合：抗体-微珠匀浆法 这是一种使抗体-微珠基质快速捕获抗原的方法，将抗原溶液与微珠混合，搅拌或振荡制成匀浆。这种方法可使抗原与固相化的抗体最大限度地接触。结合反应完成后，将匀浆装入层析柱内，以便收集结合有抗原的抗体-微珠和洗脱抗原。此法可以很好地控制反应时间，充分的利用了抗体结合容量。这比上面介绍的直接用层析柱捕获抗原方法麻烦一些。主要是因为用匀浆装柱比较困难；另一个问题是在混 ...

从免疫亲和层析柱上洗脱抗原类型 实际上，从免疫亲和层析柱上洗脱抗原的操作比较简单，而且也比较迅速。主要工作是设计和摸索各种有效的洗脱条件。可以采用三种类型的方法进行洗脱，使抗原抗体复合物解离：①使用较苛刻的条件；②加入模拟结合位点的饱和量小分子化合物，和／或③使用一种能引起构象改变而使抗原释放的试剂。 最常用的洗脱方法是基于破坏抗体与抗原之间的结合键。洗脱条件可以较为强烈，使抗体和 ...

洗脱抗原常用试剂试剂 洗脱缓冲液 预洗脱缓冲液 中和缓冲液 层析柱再使用 高pH100mM 三乙胺pH 11.5100mM 酸式磷酸盐pH 12.510mM 磷酸盐pH 8.010mM 磷酸盐pH 8.01 M 磷酸盐pH 6.81 M 磷酸盐pH 6.8经常偶而低pH100mM 甘氨酸pH 2.5 100mM 甘氨酸pH 1.810mM磷酸盐pH 6.810mM磷酸盐pH 6.81 M ...

从免疫亲和层析柱上洗脱抗原方法【准备工作】此步骤最大的难点是确定恰当的洗脱条件。为了获得一个清晰的洗脱峰和较纯的抗原，需要花费大量的时间进行试验和调整洗脱条件。【溶液和特别设备】（1）预洗脱缓冲液（2）洗脱缓冲液（3）中和缓冲液（4）简单的层析装置（5）透析袋及相应的装置 如果是对蛋白层析很有经验者可采用分段增加洗脱条件而不采用逐步洗脱。【操作步骤】(1)用20倍柱床体积的预洗脱缓冲液洗柱 ...

快速裂解酵母细胞制备样本（蛋白质的电泳分离） 使用这种方法会使蛋白质变性，在所用抗体能识别变性靶蛋白时才能使用这一方法。【试剂与设备】（1）待检测的酵母菌（2）25%三氯乙酸（TCA）（3）1%SDS（4）丙酮（5）RIPA缓冲液： 50mmol/L Tris•HCl (PH7.5) 150mmol/L NaCl 1% Nonid ...

哺乳动物细胞和组织的样本制备（蛋白质的电泳分离） 哺乳动物细胞和组织有单层培养细胞、悬浮培养细胞和组织碎片，虽然均可采用凝胶加样缓冲液裂解的方法来制备样本，但制备方法有所差异。1、对单层细胞的处理方法【试剂与设备】（1）磷酸缓冲盐溶液（PBS）（2）1×SDS凝胶加样缓冲液（参见上述“细菌表达蛋白质和样本制备”）（3）水浴箱（4）吸管、细胞刮棒等【操作步骤】（1） 用磷酸缓 ...

免疫沉淀蛋白的样本制备（蛋白质的电泳分离）一般情况下，粗提样品无需进一步纯化即可直接进行凝胶电泳。但下述两种情况在免疫印迹之前，使用免疫沉淀制备蛋白的效果较好。一是含量极稀少蛋白的检测，由于适合凝胶电泳分辨的蛋白质总量有一定限度，通常不可能在凝胶中加入足够量的蛋白质样品来检测含量极稀少的抗原，此时可采用标准的免疫沉淀技术纯化和浓缩待测蛋白；二是免疫沉淀可用来确定蛋白质与蛋白质之间的相互作用，此时 ...

细菌表达蛋白质和样本制备（蛋白质的电泳分离）【试剂与设备】（1）表达待检测蛋白质的细菌（2）50mmol/L Tris・Cl (pH7.4)（3）2×SDS凝胶加样缓冲液100mmol/L Tris・Cl (pH 6.8)200mmol/L 二硫苏糖醇（DTT）4% SDS(电泳级)0.2% 溴酚蓝20% 甘油不含有二硫苏糖醇（D ...

印迹膜蛋白染色【所需试剂】（1）2%丽春红S浓贮存液（3-羟基-4--2，7-萘二磺酸）：溶于30%三氯醋酸和30%磺基水杨酸中。贮存液可在室温下稳定存放1年以上。（2） PBS。【操作步骤】（1）在染色之前，先配制丽春红S的应用液。即将2%的丽春红S浓贮存液用1%醋酸1:10稀释即成为应用液（注意：如果使用硝酸纤维膜，须将丽春红S应用液更换为用水1:10稀释）；（2）用丽春红 ...

转印后切取印迹膜 有时转印后需将印迹剪成较小的片状进行单独处理。单个泳道可以泳动同一样品，待彼此分开后，可用不同的抗体并列检测。如以电泳方向剪膜，就可在同一样品中检测不同分子大小的抗原。为了简便而精确地找到泳道，电泳之后用丽春红S（Ponceaus S）或印度墨汁对印迹膜进行染色，便可很快确定待测蛋白质的位置并将其剪下。表表明两种染料的的适用范围及优缺点，用丽春红S染色的优点是操作简便，价 ...

蛋白质凝胶电泳凝胶的制备【材料与试剂】（1）30%的丙烯酰胺：分别称取29g 丙烯酰胺，1g NN-亚甲双丙烯酰胺加温热的去离子水60ml，加热至37℃溶解，补加水至终体积为100ml过滤，即配成30%（w/v）丙烯酰胺贮存溶液。丙烯酰胺和双丙烯酰胺在贮存过程中缓慢转变为丙烯酸和双丙烯酸，这一脱氨基反应是光催化或碱催化，故溶液的pH值不超过7.0，应置于棕色瓶中4℃保存。（2）10%十二烷基硫酸 ...

蛋白质凝胶电泳的操作方法【材料与试剂】（1）2×SDS凝胶加样缓冲液（2）聚丙烯酰胺凝胶电泳槽和电泳仪（3）加样器和吸头等（4）水浴锅【操作方法】（1） 把上述处理的样品按1:1（V/V）与2×SDS凝胶加样缓冲液混合，100℃加热3分钟，使蛋白质变性；（2） 取出变性蛋白质，立即放于冰上。样品如粘稠可进行超声对DNA进行剪切，以最大功率处理0.5～2分钟应能有效地将裂解液粘稠 ...