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        快速裂解酵母细胞制备样本(蛋白质的电泳分离)

        互联网

        2880
        快速裂解酵母细胞制备样本(蛋白质的电泳分离)
         
            使用这种方法会使蛋白质变性,在所用抗体能识别变性靶蛋白时才能使用这一方法。
         
        【试剂与设备】
        (1)待检测的酵母菌
        (2)25%三氯乙酸(TCA)
        (3)1%SDS
        (4)丙酮
        (5)RIPA缓冲液:
                 50mmol/L  Tris•HCl  (PH7.5)
                 150mmol/L  NaCl
                 1%   Nonidet  P-40 (NP-40)
                 0.5% 去氧胆酸钠
                 0.1%  SDS
        (6)玻璃珠(直径0.45~0.50mm)
        (7)台式离心机
        (8)水浴箱
        (9)涡漩振荡器
        (10)加样器与吸头等
         
        【操作步骤】
        (1)0℃以12 000g离心1min,从1ml培养物中收集细胞,废弃上清液(当靶细胞为分泌型蛋白时除外);
        (2)用0.5ml 25%三氯乙酸(TCA)重悬细胞;
        (3)按步骤1离心回收细胞,重悬于1ml 90%丙酮中;
        (4)按步骤(1)离心,估算沉淀物体积,加入等体积1%SDS重新悬浮沉淀物;
        (5)加入经酸处理的玻璃珠(直径0.45~0.50mm)至溶液的弯月面处;
        (6)振荡悬液5次,每次间歇期间将悬液置于冰浴中冷却1min,在相差显微镜下监测细胞裂解情况;
        (7)用一烧红的皮下注射器针头(23号)在微量离心管的顶盖上穿一小洞,以防加热过程中玻璃球冲出离心管;
        (8)在沸水浴中加热3min;
        (9)把玻璃珠转移到另一个微量离心管中,用0.5ml RIPA缓冲液洗涤原离心管,并把洗液合并于内装玻璃的管中;
        (10)在微量离心管底部打一小洞,回收细胞提取液,这一操作使用烧红的皮下注射器针头效果最佳。把仍装载玻璃球的微量离心管置于另一空微量离心管上,把如此重叠的一对微量离心管,于4℃以2000g离心2min;
        (11)回收下面一只内有细胞提取液的微量离心管,于4℃以2000g离心5min,使提取液澄清,移出上清液置于另一个微量离心管中,-20℃贮存备用。
         
        【注意事项】
             酵母细胞提取液储存于-20℃一般是稳定的,但是,如果待测蛋白被水解,则应在提取液中加入蛋白酶抑制剂,并保存于0℃。
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