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一、 GFP背景概述绿色荧光蛋白（green fluorescent protein, GFP）最早由Osamu Shimomura于1962年在水母（Aequorea victoria）（图2a）中发现。这种蛋白质在蓝色波长范围的光照激发下发出绿色荧光，其发光过程需要冷光蛋白质Aequorin的帮助，而且，这个冷光蛋白质可与钙离子（Ca2+）相互作用（图3）。在Aequorea victoria中发现的野生型绿色荧光蛋白的分子量较小，仅为27 ...

长期以来，肿瘤一直是严重威胁人类健康的重大疾病。目前，我国有恶性肿瘤患者约450万人，死亡率超过30%，而且每年新增的患者人数高达200万以上。然而，目前临床上治疗肿瘤的传统方法，如手术切除和放、化疗，对多数肿瘤的疗效有限，且始终未能彻底解决肿瘤复发和转移的问题，提示这些治疗手段很可能未靶向肿瘤发生发展的关键环节。新近的研究发现，部分肿瘤组织中存在少部分特殊细胞，被称为旁群细胞或SP细胞(side population ...

:)A腺苷脱氨酶缺乏症Aadenosine deaminase deficiency (ADA)定义：一种严重的免疫缺陷症，腺苷脱氨酶的缺乏可使T淋巴细胞因代谢产物的累积而死亡，从而导致严重的联合性免疫缺陷症（SCID）。通常导致婴儿出生几个月后死亡。腺嘌呤Adenine (A)定义：一种含氮碱基，是碱基对A-T（腺嘌呤-胸腺嘧啶）的一部分。腺病毒adenovirus定义：一组导致呼吸道疾病(包括常见的引起感冒)的DNA病毒。腺病毒 ...

本人刚刚开始做DNA抽提实验，遇到一些问题，请教大家。1）关于酚的PH值。我从公司买了一瓶tris饱和酚，略呈黄色，分上下两层。上层水相，下层是酚。我测了PH值，上层PH值是8，下层是5左右，我用试纸测的，没敢拿PH计测。问题是分子克隆那本书上说酚用tris平衡至PH值8.0，可是现在买的酚却是酸性的，怎么办呢？是自己再用tris平衡还是直接就能用啊？请有经验的战友解答,可能问题很菜，呵呵，谢谢大家帮忙。2）提取细胞DN ...

RNA干涉（RNAi）1995年，康乃尔大学的Su Guo博士在试图阻断秀丽新小杆线虫（C. elegans）中的par-1基因时，发现了一个意想不到的现象。她们本是利用反义RNA技术特异性地阻断上述基因的表达，而同时在对照实验中给线虫注射正义RNA（sense RNA）以期观察到基因表达的增强。但得到的结果是二者都同样地切断了par-1基因的表达途径。这是与传统上对反义RNA技术的解释正好相反的。该研究小组一直没能给这个意 ...

重组质粒一月有余，颇有心得，与各位战友分享如下：1：关于双酶切的Buffer，一直是酶切的重点。有人喜欢A酶切完回收再B酶切，其实可以通过NEB网站上查询大部分双酶共切的Buffer问题，常见的双酶搭配甚至可以找一本TAKARA或者其他公司的Catalog，内切酶部分在前面肯定就有双酶切的Buffer推荐表。有些酶没有搭配的推荐，但是有各种酶在L，M，H，K及T+BSA的相对活性，AB两酶选一个合适的即可。注意尤 ...

一、miRNA的定义　　miRNA(microRNA)是一组由基因组编码的长度约20～23个核苷酸的非编码RNA，通过和靶基因mRNA碱基配对引导沉默复合体(RISC)降解mRNA或阻碍其翻译。　　miRNA(microRNA)在物种进化中相当保守，在植物、动物和真菌中发现的miRNA(microRNA)大部分在特定的组织和发育阶段表达。miRNA(microRNA)的组织特异性和时序性，决定组织和细胞的功能特异性，表明miR ...

一、基因芯片：1、基因芯片综合分析软件。ArrayVision 7.0一种功能强大的商业版基因芯片分析软件，不仅可以进行图像分析，还可以进行数据处理，方便protocol的管理功能强大，商业版正式版：6900美元。Arraypro 4.0Media Cybernetics公司的产品，该公司的gelpro, magepro一直以精确成为同类产品中的佼佼者，相信arraypro也不会差。phoretix™ Array Nonlinear Dyn ...

今天老师让我找一些比苯酚氯仿抽提法更简单的方法。通过专利文献和杂志，发现了一些简单的方法。现小结一下---血清中病毒DNA的提取一 煮沸法从血清中提取病毒DNA，与其它方法比较，此法最为简单，并且很多文献都有报道 。鲁艳芹等在一篇名为《乙型肝炎病毒荧光定量PCR检测方法及专用试剂盒》专利(专利申请号为200610044679)中对六种方法提取血清中乙型肝炎病毒DNA的效率做了比较，得出结果是：NaOH裂解法最佳，其次是直 ...

题录集：静脉大容量快速注射siRNA或质粒有些老师曾经认为通过小鼠尾静脉注射200微升质粒液体都很困难。而现在，小鼠尾静脉注射1.3毫升的siRNA或质粒已经快成了在整体动物水平快速鉴定某个基因功能的标准手段。这种大容量快速注射还可以用于兔子、狗等大型动物。除了尾静脉是可以输入核酸的路径之外，还可以通过门静脉、肾静脉、下肢静脉等进行局部灌注。所以，以前用于反义核酸(ODN)的一些体内delivery手段，还可以 ...

〓〓〓〓〓〓〓〓〓〓 2007年零应助帖/疑难帖集合〓〓〓〓〓〓〓〓〓〓已应助帖不代表求助已经解决，鼓励战友继续积极应助，加分机会与尚未应助帖均等不规范贴不在此次整理范围，请大家规范发贴请大家在发帖前仔细阅读版规,细心搜索文献资料及丁香园内部后再发求助帖,以减少版主和其他热心战友的工作量.谢谢!1.【求助】T4 DNA Pol 补平http://www.dxy.cn/bbs/post/view?bid=64&id=9229803&sty=1&tpg=25&a ...

对于一些生物测序公司（ 如Invitrogen等），我们的菌液或质粒经过PCR和酶切鉴定都没问题，但几天后的测序结果却无法另人满意。为什么呢？PCR产物直接进行测序，在PCR产物长度以后将无反应信号，机器将产生许多N值。这是由于Taq酶能够在PCR反应的末端非特异性地加上一个A碱基，我们所用的T载体克隆PCR产物就是应用该原理，通常PCR产物结束的位点，PCR产物测序一般末端的一个碱基为A（绿峰），也就是双脱氧核甘酸 ...

刚进实验室学技术 ，看到复旦大学某教授写的有关质粒的好文，贴在这里与大家共享（最后的问题也希望各位能解答一下：）：从质粒抽提谈起碱裂解法从大肠杆菌制备质粒，是从事分子生物学研究的实验室每天都要用的常规技 术。可以我收研究生十几年了，几乎毫无例外的是我那些给人感觉什么都知道的优秀学生 却对碱法质粒抽提的原理知之甚少。追其原因，我想大概是因为《分子克隆》里面只讲实 验操作步骤，而没有对原理进行详细的论述。这是导致我的学生误入歧途的 ...

〓〓〓〓〓〓〓〓〓〓 2007年零应助帖/疑难帖集合〓〓〓〓〓〓〓〓〓〓 已应助帖不代表求助已经解决，鼓励战友继续积极应助，加分机会与尚未应助帖均等不规范贴不在此次整理范围，请大家规范发贴1.请问pcDNA3.1能作为RNAi的质粒载体使用吗？http://www.dxy.cn/bbs/post/view?bid=64&id=9188774&sty=1&tpg=32&age=02.点突变没结果http://www.dxy.cn/bbs/post/view?b ...

（一）外源ＤＮＡ和质粒载体的连接反应　　外源ＤＮＡ片段和线状质粒载体的连接，也就是在双链ＤＮＡ５'磷酸和相邻的3'羟基之间 形成的新的共价链。如质粒载体的两条链都带5'磷酸，可生成４个新的磷酸二酯链。但如果质粒ＤＮＡ已去磷酸化，则吸能形成２个新的磷酸二酯链。在这种情况下产生的两个杂交体分子带有２个单链切口，当杂本导入感受态细胞后可被修复。相邻的５'磷酸和３'羟基间磷酸二酯键的形成可在体外由两种不同的ＤＮＡ连接酶催化，这两 ...

问题：原因解决办法DNA完全没有被内切酶切割：1) 内切酶失活标准底物检测酶活性2) DNA不纯，含有SDS，酚，EDTA等内切酶抑制因子将DNA过柱纯化，乙醇沉淀DNA3) 条件不适（试剂、温度）检查反应系统是否最佳4) DNA酶切位点上的碱基被甲基化换用对DNA甲基化不敏感的同裂酶酶解，重新将质粒DNA转化至dcm-，dam-基因型的细菌菌株5) DNA酶切位点上没有甲基化（如Dpn I）换用不同切割非甲基化位点的同裂酶消化DNA（如S ...

RNAi介绍1. RNAi现象RNA 干涉（或者叫做RNA干扰）指的是细胞内由双链RNA诱导降解与其配对的特定mRNA的过程。在一些生物系统中，少量拷贝的双链RNA能导致细胞内所有同源基因的降解。这个现象在进化过程中保守而且广泛，许多基因在这个过程中发挥了重要的作用。 人们发现这个现象在线虫、昆虫、哺乳动物、植物和真菌中广泛存在。而在RNAi现象在线虫中发现之前，其机制被认为是一种转录后基因沉默，共抑制或者是压制，被认为是 ...

蛋白标签（protein tag）是指利用DNA体外重组技术，与目的蛋白一起融合表达的一种多肽或者蛋白，以便于目的蛋白的表达、检测、示踪和纯化等。随着技术的不断发展，研究人员相继开发出了具有各种不同功能的蛋白标签。一、 新型蛋白标签蛋白标签应用极为广泛，但仍有两个问题不容忽视：（1）蛋白标签以DNA形式编码，它需要转录并翻译成蛋白后才能发挥作用，而这种作用方式本身就是一种缺陷。例如，常用的荧光蛋白标签，在显微镜下观察时，其显 ...

外源ＤＮＡ片段和线状质粒载体的连接外源ＤＮＡ片段和线状质粒载体的连接，也就是在双链ＤＮＡ５'磷酸和相邻的3'羟基之间 形成的新的共价链。如质粒载体的两条链都带5'磷酸，可生成４个新的磷酸二酯链。但如果质粒ＤＮＡ已去磷酸化，则吸能形成２个新的磷酸二酯链。在这种情况下产生的两个杂交体分子带有２个单链切口，当杂本导入感受态细胞后可被修复。相邻的５'磷酸和３'羟基间磷酸二酯键的形成可在体外由两种不同的ＤＮＡ连接酶催化，这两 ...

本人持有以下载体及基因：（原则上只交换不赠送，欢迎广大站友互通有无）QQ 2283524599 luckamily@126.com一、载体1)、miRNA载体Promega miRNA靶标克隆载体 psiCHECK-2 psiCHECK2 ampAmbion miRNA靶标克隆载体 pmiR-report pmiRreport ampInvitrogen miRNA过表达载体 PCDNA TM 6.2-GW/EmGFP-miR2)、哺乳动物/真核表达载体pcDNA3.1+ 不 ...