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本人做的植物转基因技术方向，由于要做一些杂交技术来验证外源基因的整合与表达情况，故将自己在做实验中遇到的一些问题以及注意事项想告诉大家，同时希望和朋友们一起交流探讨。Southern Blot:1.首先是提取大量DNA，由于不同的材料的基因组大小不一样，故上样量也不同，但上样量还是要大一些为好，一般30-50微克左右，若你的DNA质量非常好，一般20微克左右就可以，有的材料如獐茅10微克就可以。注意，上样量与DNA质 ...

精华【连接转化讨论专栏】 连接反应大全 【鸡毛蒜皮】之5－连接反应中巧用内切酶 连接技术讨论区PCR与连接PCR连接关于PCR产物及酶切产物与载体的连接 PCR产物与表达载体连接的问题PCR产物能够直接用做T-载体的连接吗平端连接 平端连接高手（讨论专贴）平端连接平端连接的怪现象? 平端连接的怪现象(2)平末端连接的条件？ 平末端连接构建载体的一些个人经验连接问题集 连接的问题关于连接偶的连接问题！还是连接问题求助：DNA连接问题关于连接的 ...

在哺乳动物细胞中进行RNA干扰:设计，实验和分析siRNA效应转录后基因沉默，也称为RNA干扰，是指双链RNA分子阻断或者降低同源基因的表达的现象。这种现象可能是作为一种抑制病毒感染和转座子跳跃的细胞防御机制(Ketting et. al., 1999; Tabara et. al., 1999; Jensenet. al., 1999; Ratcliff et. al., 1999)。在体内，双链RNA被内源的核糖核酸酶降解为21-23个碱基大小的小分子干扰RNA（small i ...

目的:构建目的基因的真核表达载体 历时整整一学期,期间经历了很多挫折,遇到很多问题,也从中学到很多经验.借寒假的时间写了写我一学期构建的经历,把我的一点经验拿出来和大家分享讨论.分步来说:一.PCR扩增得到目的片段1.引物的设计与合成:这里有很多血与泪的教训。我前后一共送过九个载体测序，其中居然有五个是引物出错。最后一次挑的两个克隆都是上游引物出错（此上游引物40个碱基） ，后来和这家引物公司交涉，他们拿走了我的板子，一次 ...

核酸、核苷酸的基本换算DNA电泳基本参数Pfu DNA聚合酶BCIP/NBT & BCIP/INTHistoChoice MBHistoChoice Clearing Agent核酸、核苷酸的基本换算1．核酸的换算：(1)摩尔数与质量：1 μg 1,000bp DNA = 1.52 pmol1 μg pUC18/19 DNA (2,688bp) = 0.57 pmol1 μg pBR322 DNA (4,361bp) = 0.35 pmol1 μg SV40 DNA (5,243bp) = 0.29 pmol1 μg FX174 DNA (5,386bp) = 0.28 pmo ...

我用附件传不上来，只能用这种笨法了，希望大家用的上　　近年来的研究表明，将与mRNA对应的正义RNA和反义RNA组成的双链RNA(dsRNA)导入细胞，可以使mRNA发生特异性的降解，导致其相应的基因沉默。这种转录后基因沉默机制(post-transcriptional gene silencing, PTGS)被称为RNA干扰（RNAi）。 　　一、RNAi的分子机制　　通过生化和遗传学研究表明，RNA干扰包括起始阶段和效应阶段(initita ...

最近，摸索了一下PEG沉淀PCR产物的方法，贴出来，与大家共享。摸索这个方法的目的主要是，探索一种方法，能将PCR产物大批量地、廉价地、纯度比较高地纯化出来，并且最好能去掉200bp以下的小片段DNA，用于DNA测序。有文献和方法说，不同浓度的PEG能沉淀不同长度的DNA，所以，先做了一下不同PEG浓度对DNA沉淀的作用，见下图，标本是用的50bp DNA Marker，上一行Marker溶解在纯水里面的，下一行Marke ...

第一节 基因和基因组一、基因(gene)是合成一种功能蛋白或RNA分子所必须的全部DNA序列．一个典型的真核基因包括①编码序列—外显子(exon)②插入外显子之间的非编码序列—内合子(intron)③5'-端和3'-端非翻译区(UTR)④调控序列(可位于上述三种序列中)绝大多数真核基因是断裂基因(split-gene)，外显子不连续。二、基因组(genome)一特定生物体的整套(单倍体)遗传物质的总和，基因组的大小用全部DNA的碱基 ...

半个月前我正式进入实验室学习，老实说，这半个月是痛苦的，也让我感受颇多，这里我愿意把自己的心得和大家分享，尤其希望对那些和我一样刚进实验室或将要进的园友有点帮助。今年是我研究生的第二年，第一年是理论学习，没有进实验室，我老板是领导，脱离科研好多年了，对我们的学习几乎没什么指导，对这一阶段，我的惨痛教训如下：⒈学习，学习，努力学习，千万别逃课，崩管老师好不好，听听总好，说不定什么时候就有启发，千千万万是那门分子生物学及技 ...

Blast指南http://www.dxy.cn/bbs/user/download/385095/BLAST%20tutorial%20%28part%201%29.htm如何进行BLAST,如何分析BLAST后的结果,请访问http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Education/BLASTinfo/tut1.htmlblast 讲座幻灯片http://www.dxy.cn/bbs/post/view?bid=64&i ...

一．实验材料及其仪器1．实验仪器iQ5 Real Time PCR Detection System： Bio-Rad2．实验材料及试剂All-in-OneTM miRNA Q-PCR Detection Kit： GeneCopoeia (Cat. No. R0101S )验证模板：人源十个不同的组织所制备的cDNA测试引物：共5 对（具体引物序列等详细信息附在产品说明书处，此处略）Catalog# Primer ID Mature_Acc Mature_ID PCR SIZE1 miRQP0227 hsmq ...

总RNA提取具体步骤：（关键是防止RNA酶的污染）⑴1) 称取-85℃冰冻保存的标本50-100mg，于液氮中夹碎(用剪刀将组织块剪成若干碎块)(须避免RNA酶的污染)。2) 将组织碎块加入1ml TRI zol变性缓冲液中(所加组织块的体积不能超过TRIzol体积的10%)，在玻璃匀浆器中充分研磨至无明显大的组织块为止，研磨过程在0℃冰水中进行，以防止组织RNA被降解。⑵ RNA的分离3) 然后将组织匀浆液转移到1.5ml的Eppendorf管 ...

第三代测序技术简介 转自sciencenet 作者 廖新化如果有人告诉你用显微镜实时观测单分子DNA聚合酶复制DNA，并用它来测序，你一定会认为他异想天开，没有一点生物的sense。我最初就是这样认为的，然而它不仅可以实现，而且已经实现了！这个就是被称为第三代的测序技术，Pacific Biosciences公司推出的“Single Molecule Real Time (SMRT™) DNA Sequencing”（单分子实时DNA测序）。我有幸在 ...

整理整个定向园的关于细胞转染的内容如下：干细胞转染率的问题骨髓基质干细胞转染BMP-2骨形成蛋白后分化为骨细胞，之后其转染基因还会长期表达吗？★以上为干细胞与组织工程讨论版版块发表的帖子，共：2个★p19 细胞转染的请教promega用于细胞转染的试剂盒的质粒提取问题,谢谢关于PC12细胞转染请教关于稳定转染的问题，是在受不了了。中秋节，顺便祝丁香园的各位兄弟姐妹中秋快乐,试验顺利！请教关于细胞转染的问题？请教关于 ...

一些分子生物学常用实验技术方法大肠杆菌感受态细胞的制备和转化第一节 概 述　　在自然条件下,很多质粒都可通过细菌接合作用转移到新的宿主内,但在人工构建的质粒载体中,一般缺乏此种转移所必需的mob基因,因此不能自行完成从一个细胞到另一个细胞的接合转移。如需将质粒载体转移进受体细菌，需诱导受体细菌产生一种短暂的感受态以摄取外源DNA。　　转化(Transformation)是将外源DNA分子引入受体细胞,使之获得新的遗传性状的一种 ...

琼脂糖和聚丙烯酰胺凝胶电泳是分离、鉴定和纯化核酸和蛋白质片断的标准方法。聚丙烯酰胺凝胶电泳片段的回收将在以后的文章中介绍，在这里我先介绍一下琼脂糖凝胶电泳片断回收的常用方法，方便大家学习交流。从琼脂糖凝胶中回收DNA，是一种简单不过的常规实验操作。但是由于胶回收的质量和数量直接影响后继的一系列实验――比如酶切连接、转化筛选、测序或者PCR扩增、标记乃至显微注射等等，所以这一步的操作也显得非常重要。胶回收的质量好 ...

Northern Blot继分析DNA的Southern杂交方法出现后，1977年Alwine等人提出一种与此相类似的、用于分析细胞总RNA或含poly A尾的RNA样品中特定mRNA分子大小和丰度的分子杂交技术，这就是与Southern相对应而定名的Northern杂交技术。这一技术自出现以来，已得到广泛应用，成为分析mRNA最为常用的经典方法。与Southern杂交相似，Northern杂交也采用琼脂糖凝胶电 ...

20个测序常见的问题1．为什么需要新鲜的菌液？首先，新鲜的菌液易于培养，可以获得更多的DNA，同时最大限度地保证菌种的纯度。2．如何提供菌液？如果您提供新鲜菌液，用封口膜封口以免泄漏；也可以将培养好的4～5ml菌液沉淀下来，倒去上清以方便邮寄。同时邮寄时最好用盒子以免邮寄过程中压破。3．如何制作穿刺菌？用灭菌过1.5ml或2ml离心管加入LB琼脂(7g/L)斜面凝固，用接种针挑取分散良好的单菌落穿过琼脂直达管底，不完全 ...

非常感谢lewis 1121！！！另外在论坛中找到部分关于滤纸上质粒溶解提纯保存的方法，贴在这里，供同道参考。（没有进行系统整理，也未按原发贴顺序，详情还请见原文）请问：如何从滤纸上洗涤下质粒DNA？(dxyshining )我是这样做的,加入PH8.0 TE,边加边用枪尖压实滤纸,直至确认能吸出一点液体,然后用这液体去做转化.记住要留出点呵.滤纸也不要马上扔掉. (楚风)4度下TE浸泡过夜,次日即可使用....(roger )１。滤纸有质粒部 ...

原位杂交的基本方法一、组织的取材注意事项：刀要锋利、不能用力向下挤压组织； 组织块不宜过大、及时固定。二、固定（一）原则：及时固定、避免RNA酶的污染4％多聚甲醛（0.1M PBS PH7.4，可加1/1000的DEPC）,动物实验标 本最好先灌流固定。（二）固定液的浓度、固定时间及温度要适宜1 浓度越高组织结构保存的越好，但mRNA的保存越差；2 固定时间越长，mRNA破坏的越多；做原位杂交组织固定时间不宜过长，一般24h，不能高温固定（微波可使组 ...