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我正在做用SYBR GREEN I做荧光染料的实时定量PCR，遇到的问题不少，同时也有点心得，借些平台和各位站友交流，望各位给以指证和帮助。首先，主要的问题是反应效率低下：我用10-1 ～10-9 的浓度梯度的反转录产物作为模板，预设它们的浓度是1×10-1 ～10-9 ，结果作出的各个模板浓度对应的CT值与理论完全相反，即：浓度越小，反应曲线就越快地起峰，就是CT值越小。作溶解曲线有时单峰，有时是双峰。BIO-RAD的ICYCLER软件作 ...

聚合酶链式反应(PCR)扩增和扩增产物克隆Ⅰ、 概 述　　PCR(Polymerase Chain Reaction,聚合酶链反应)是一种选择性体外扩增DNA或RNA的方法.它包括三个基本步骤: (1) 变性(Denature):目的双链DNA片段在94℃下解链; (2) 退火(Anneal):两种寡核苷酸引物在适当温度(50℃左右)下与模板上的目的序列通过氢键配对;(3) 延伸(Extension):在Taq DNA聚合酶合成DNA的最适温度下,以目的DNA为模板进行 ...

我对引物设计的一些建议很多人都想学会引物设计及软件的应用，这些其实很简单，看看书大致原则就清楚了，但仍然很少有书介绍引物的设计流程，我将自己的一点体会在这里和大家交流。但愿初学者能有所收获。1．首先要明确设计引物的目的。是检测还是构建，是克隆还是表达，表达还分原核与真核表达之分。检测：一般说来，检测引物的设计相对简单。但若要求特异性，则需分析被检测的基因是否有高度同源性，这一般在引物设计完后在genbank上bl ...

我以前在一家引物合成公司做技术支持，主要解答客户各种因为引物质量问题引发的实验问题），现在自己合成引物自己做实验用，对引物质量问题有了更进一步的认识，写出来跟大家共享一下吧，也让大家能判断什么时候是自己的问题，什么时候是运气不好碰上了小概率事件，什么时候是合成公司的问题。我也顺便整理一下思路，最近一个月一直看那些引物合成的文献，头都大了。现在引物质量问题主要体现在三个方面：1、pcr产物测序发现引物部分碱基错误 ...

用石蜡组织提DNA做MSPhttp://www.dxy.cn/bbs/post/view?bid=67&id=6074962&sty=1&tpg=17&age=0【求购】求购内切酶BbsIhttp://www.dxy.cn/bbs/post/view?bid=67&id=5999059&sty=1&tpg=29&age=0【求助】http://www.dxy.cn/bbs/post/view?bid=67&id=6081074&sty=1&tpg=16 ...

先找到需要设计引物的目标基因的在有引物序列的mRNA序列，可以通过全文（如最先发现该基因的文章），全文中有时可以找到大鼠c-jun mRNA序列的ACCESSION NUMBER，在PubMed中的“Nucleotide”中用此ACCESSION NUMBER就能找到序列。可以利用这个ACCESSION NUMBER在PubMed中的“Nucleotide”中搜索到序列后，点击右边的“Links”，再点击里面的“Related Se ...

PCR反应的最大特点是具有较大扩增能力与极高的灵敏性，但令人头痛的问题是易污 染，极其微量的污染即可造成假阳性的产生.一、污染原因　　(一)标本间交叉污染:标本污染主要有收集标本的容器被污染，或标本放置时，由于 密封不严溢于容器外，或容器外粘有标本而造成相互间交叉污染;标本核酸模板在提 取过程中，由于吸样枪污染导致标本间污染;有些微生物标本尤其是病毒可随气溶胶 或形成气溶胶而扩散，导致彼此间的污染.　　(二)PCR试剂的污染:主要是由于在P ...

xjktony扩增模板的GC 含量为66％,也不算很高,我做过更高的GC 含量(80%)的PCR.对于这种高GC含量的PCR,要加些DMSO等,以解除其二级结构的影响,当然现在也有专门这种PCR Buffer卖.vanny宝生物有这种做高GC含量的酶和buffer，称为LA TAKARA酶，里面有GC buffer，效果还不错。westernblot你用DMSO5％加到里面，60％应该不是算高的，如果实在不行，就用advantage 2 high ...

PCR 引物设计及软件使用技巧摘要：本文旨在介绍使用软件设计PCR 引物的技巧。在PCR 引物设计原则的基础上，详细介绍了两种常用引物设计软件的基本使用方法，并对其各自的优缺点进行了比较。一般性引物自动搜索可采用“Premier Primer 5”软件，而引物的评价分析则可采用“Oligo 6”软件。关键词：PCR；引物设计中图分类号：Q524 文献标识码： 文章编号：1自从1985 年Karny Mullis 发明了聚合酶链式反应以来，PCR 技术已成为分子 ...

PCR实用技巧增加PCR的特异性：1. primers design这是最重要的一步。理想的，只同目的序列两侧的单一序列而非其他序列退火的引物要符合下面的 一些条件a. 足够长,18-24bp,以保证特异性.当然不是说越长越好,太长的引物同样会降低特异性,并且降低产量b. GC% 40%~~~~60% c. 5'端和中间序列要多GC,以增加稳定性d. 避免3'端GC rich, 最后3个BASE不要有GC,或者最后5个有3个不要是GCe. 避免3'端的互补, 否则容易造成DI ...

生物谷： RT-PCR实验有三步：抽提RNA，RT，PCR。要求：1.做RT前必需测RNA浓度，逆转录体系对RNA量还是有一些要求，常用500ng或1ug。2. RT按要求做，一般不会出太大问题。3. PCR，按常规。但如需扩长片段，则对前两步要求较高，需要有完整的cDNA存在，不是单改变Mg2+浓度、退火温度能解决的。1）RT和PCR时的引物设计是不是一定要先知道目的基因的序列？必须在RT时，引物设计有3种方法即a：Random 9me ...

该贴转自生物试验网2007年9月14日发表的文章实时定量PCR以其精确、快速、方便，越来越多的应用在科研、临床及检验检疫的各个领域。但是定量PCR是对精确性要求很高的实验，实验的条件对实验结果的影响非常大。在此谈谈体系优化的问题，希望对做相关试验研究的战友有所帮助1.基本参数的优化：1）MgCl2的浓度：在PCR反应中，MgCl2的浓度对酶的活性是至关重要的，不仅如此，合适的MgCl2的浓度还能在反应中得到较低 ...

PCR实验操作程序1. 在无菌的0.5ml或0.2ml离心管中按下列操作程序加样：反应物 加样顺序 体积(μl) 终浓度去离子水 1 29.410×Buffer B 2 5 1×4×dNTP混合物 3 5 各200μmol/LMgCl2 4 3 1.5mmol/L有义引物 5 2.6 0.25μmol/L反义引物 6 2.6 0.25μmol/L模板 7 2 0.1μgTaqDNA聚合酶 8 0.4 1unit2.用微量可调加样器和一次性Tip向每一管中加50μl矿物油。每加一管换一次Tip。3.振荡每只管，然后短暂离心。4.将管放到 ...

提问：降落PCR（Touchdown PCR）的原理？回答：Touchdown PCR是指每隔一个循环降低1°C反应退火温度，直至达到“Touchdown”退火温度，然后以此退火温度进行10个左右的循环。该方法最初出现是为了避开确定最佳退火温度而进行的复杂的反应优化过程。正确和非正确退火温度之间的任何差异将造成每个循环PCR产物量的两倍差异（每摄氏度造成4倍差异）。因此相对于非正确产物，正确的产物可以得到富集该方法的另一 ...

以下为自己参考书籍整理，希望能对新手有一点帮助。我自己也是新手，想和大家共同进步！影响PCR反应的参数PCR反应的基本成分PCR包含7种基本成分1.热稳定DNA聚合酶：常规PCR，最常选用Taq DNA聚合酶（每个标准的25～50μl反应体系用0.5～2.5U）。（实验室Taq DNA聚合酶为5U/μl）2.一对引物： 这是影响PCR反应的最关键因素。标准PCR反应每条引物的典型浓度是0.1～0.5 μmol/L。（实验室所用引物按要求稀 ...

关于新基因的克隆，有几种方法，其中关于PCR的有：1．简并引物PCR法根据编码氨基酸的密码子的摇摆性，将编码一种氨基酸的多个密码子并列设计成一组引物进行PCR扩增，适用于克隆已知氨基酸序列的基因、某基因家族的新成员和不同物种的同源基因。可根据氨基酸序列推测核酸序列，或根据基因家族已知成员的核酸序列，选其保守区或相对保守区设计简并引物，然后用PCR法从一定组织的cDNA文库中扩增目的基因。该法结合3’RACE（r ...

PCR技术简介　前言一滴残留在裙子上的精液使得美国总统Bill Clinton不得不坦承他与白宫实习生有不正当的关系。因为他知道现在的生物科技就连一个精子也能被用来做为证据。这种将极微量的生物标本化为可供鉴定的现代技术正是PCR(Polymerase chain reaction)--聚合酶链式反应具有的特色之一。这也是分子生物医学令人震撼的一例。何谓PCR简单的说，PCR就是利用DNA聚合酶对特定基因做体外或试管内 (In V ...

真核生物mRNA的纯化以及cDNA文库的构建把带聚腺苷酸的mRNA

Q1．CT值出现过晚1.扩增效率低，反应条件不够优化。设计更好的引物或探针；改用三步法进行反应；适当降低退火温度；增加镁离子浓度等。2.PCR各种反应成分的降解或加样量的不足。3.PCR产物太长。一般采用80-150bp的产物长度。Q2．无CT值（信号）出现1.反应循环数不够。一般都要在35个循环以上，可根据实验情况增加循环（如至45cycles），但高于45个循环会增加过多的背景信号。2.检测荧光信号的步骤有误。一般SG ...

随着分子生物学技术的发展，检测基因结构和突变的方法不断涌现。尤其是PCR技术问世以后，各种与PCR相结合的基因检测技术进一步推动了基因研究的发展。如不对称PCR产物的直接测序、核糖核酸酶酶切法(Ribonuclease cleavage，RNAase)、限制性片段长度多态性分析(Restriction Fragment Length Polymorphism，RFLP)等等已成为基因分析的有力工具.但这些方法操作比较繁琐，局限 ...