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再求助内参，接上次？http://www.dxy.cn/bbs/post/view?bid=67&id=5744926&sty=1&tpg=7&age=0人口腔鳞癌Tca-8113细胞 端粒酶检测引物设计和内参引物http://www.dxy.cn/bbs/post/view?bid=67&id=5745223&sty=1&tpg=7&age=0搞不懂的PCR结果http://www.dxy.cn/bbs/post/view?bid=67&id=57 ...

如何做标准曲线求助：EB毒理学资料求助：酵母总RNA的提取请问这样的实验如何操作？看引物设计得行不行ABI与MJ荧光定量哪个好如何知道我的引物包含有内含子序列多重PCR过程中退火温度如何掌握pcr扩增后的DNA在跑agarose胶之前还需不需要处理一下看我设计的大鼠IL－6引物行不求助RNA提取问题请大家帮忙看看我的引物PCR-ARMS是怎么个做法克隆一种野生大米谷蛋白的编码序列并测序的疑问［求助］AP ...

PCR产物的电泳检测时间　　一般为48h以内，有些最好于当日电泳检测，大于48h后带型不规则甚致消失。假阴性，不出现扩增条带　　PCR反应的关键环节有①模板核酸的制备，②引物的质量与特异性，③酶的质量及， ④PCR循环条件。寻找原因亦应针对上述环节进行分析研究。　　模板：①模板中含有杂蛋白质，②模板中含有Taq酶抑制剂，③模板中蛋白质没有消 化除净，特别是染色体中的组蛋白，④在提取制备模板时丢失过多，或吸入酚。⑤模 板核酸变性不彻底。在酶和引物质量好时 ...

大家好,我都快急哭了,希望各位多多关照...我刚进实验室,老板就给我一课题,就是做病毒外壳蛋白基因的原核表达,我查了大量资料,一点头绪都没有.首先我要设计引物,这是我最大的难题.因为没有人带我,只有自己摸索,万般无奈下,我只好来到丁香家园向大家求救.下面是我课题一些情况:我要作的病毒CP基因序列:ORIGIN1 atgggcacca acaagccagc cactctagct gatttgcaga aggcaattaa tggcatctc ...

目的：RT-PCR克隆全长目的基因做表达基因11: M25157. Rat Cu, Zn supero... LinksLOCUS RATSODCZL 601 bp mRNA linear ROD 27-APR-1993DEFINITION Rat Cu, Zn superoxide dismutase mRNA, complete cds.ACCESSION M25157VERSION M25157.1 GI:207011KEYWORDS superoxide dismutase.SOURCE Rattus norveg ...

1.问题：RT-PCR灵敏度：在琼脂糖凝胶分析中看到少量或没有RT-PCR产物。可能原因：1）RNA被降解建议解决方法：在用来验证完整性之前先在变性胶上分析RNA使用良好的无污染技术分离RNA；在将组织从动物体取出后立刻处理在100％甲酰胺中储存RNA；如果使用胎盘RNase抑制剂，不要加热超过45℃或pH超过8.0，否则抑制剂或释放所有结合的RNase。而且，在≥0.8mM DTT时加入RNase抑制剂，一定要存在DTT ...

众所周知,PCR技术以其高敏感性在分子生物学上得到了广泛应用,然而每一种方法再其优势方面的同时,其不可避免存在相关的问题,比如PCR技术的高敏感性是不是与其高特异性是一对矛盾??本人就个人研究过程中的经验总结几点所得,希望能为大家起到抛砖引玉的作用.首先,先提出影响PCR特异性的几个方面和解决方法:1. 引物序列不用多说,引物与模板的匹配是PCR成功扩增的关键,尤其上下游引物3'端的序列一定是要匹配的,但究竟要几个 ...

近来做2个基因的半定量分析，对RT的中RNA的用量问题一直没搞得很懂，也没有权威的资料可供参考，在园子里Search 了很久也没有得到理想的东西，无意中在生物谷得到了下文，虽然没有权威的出处说明，但也颇受启发，遂转来供正在做RT-PCR并和我一样处于郁闷的同仁们分享：http://www.bioon.com/experiment/pcr/pcr5/Index.htmlRT-PCR实验有三步：抽提RNA，RT，PCR。 要求：1.做 ...

参考体系酶切体系（参考）：质粒 17ulbuffer 2ul酶 1ul－－－－－－－－－－37度，过夜。酶切位点在质粒上，所选的两个酶的酶切位点不可以靠的太近，如6bp建议载体质粒不要用双酶切,用两次单酶切之后切胶回收.另外建议加多以下两个个步骤:1.PCR产物的酶切片断做TA克隆,之后再酶切回收,与载体相连.2.目的片段与载体连接之后建议先转化DH5α这些容易转化的菌株. 然后筛选到的阳性克隆测序之后,提质粒,用质粒转化BL21,转化率很高 ...

PCR的问题，无疑是绝大多数学生物的人都关心的问题，小编将相关内容整理出来，与大家交流讨论，希望对大家有所帮助。由于内容过多，分成了几个部分：引物设计、PCR成分、PCR反应参数、提高PCR扩增特异性、PCR污染与对策。　　好东西收藏在手边，查看其它系列内容，请在GCBI微信页面输入“PCR”，即可查看下面的内容：　　引物设计　　PCR成分　　PCR反应参数　　提高PCR扩增特异性　　PCR污染与对策　　所谓“工欲善其事，必先利其器”，设计引物常用软件：在线P ...

问题1:不出现扩增条带引物：引物质量是PCR失败或扩增条带不理想、容易弥散的常见原因。对策为：①选定合适的引物合成单位；②引物的浓度不仅要看OD值，最好用引物原液做琼脂糖凝胶电泳，如一条引物有条带，一条引物无条带，此时做PCR有可能失败，应与引物合成单位协商解决，如一条引物亮度高，一条引物亮度低，在稀释引物时要平衡其浓度；③引物应高浓度小量分装保存，防止多次冻融或长期放冰箱冷藏而导致变质降解失效；④引物设计不合理，如引 ...

影响PCR结果的关键因素总结前人所说，多指教！理想的PCR反应应该是特异、高效、忠实的。研究表明PCR结果的特异、高效、忠实性都受反应中众多成分的影响，包括缓冲条件、PCR循环方式（温度和每一步的持续时间）以及DNA聚合酶等。而许多研究人员往往把PCR结果的不理想过多的归罪于引物合成的质量。其实想得到一个好的PCR结果除了要有高质量的引物外，还需要对以下每个因素的恰当控制。1，模板包括基因组DNA、质粒DNA和噬 ...

品牌不是唯一，高性价比的荧光定量PCR仪选购指南从1996年ABI公司推出了全球第一款荧光定量PCR以来，经过10几年的发展，由于荧光定量PCR仪的在科研、检测和诊断领域的广泛应用，市场规模也不断扩大。已有多家国内外生产厂商涉足研发生产,就连Eppendorf公司也于2006年底推出了自己的荧光定量PCR仪。这些产品良莠不齐，令研究人员选择是不免挑花了眼。于是很多资金充足的实验室为了保险起见都选择购买了几家 ...

增加PCR的特异性：1. primers design这是最重要的一步。理想的，只同目的序列两侧的单一序列而非其他序列退火的引物要符合下面的 一些条件a. 足够长,18-24bp,以保证特异性.当然不是说越长越好,太长的引物同样会降低特异性,并且降低产量b. GC% 40%~~~~60% c. 5'端和中间序列要多GC,以增加稳定性d. 避免3'端GC rich, 最后3个BASE不要有GC,或者最后5个有3个不要是GCe. 避免3'端的互补, 否则容易造成DIMER f. 避免3'端 ...

PCR常见问题及对策（一）没有得到扩增产物（1）酶失活或在反应体系中未加入酶。Taq DNA聚合酶因保存或运输不当而失活，往往通过更换新酶或用另一来源的酶以获得满意的结果。（2）模板含有杂质。特别是对甲醛固定及石蜡包埋的组织常含甲酸，造成DNA脱嘌呤而影响PCR的结果。（3）变性温度是否准确：PCR仪指示温度与实际温度是否相符，过高酶在前几个循环就迅速失活；过低则模板变性不彻底。（4）反应系统中污染了蛋白酶及核酸酶，应在 ...

RT-PCR实验有三步：抽提RNA，RT，PCR。要求：1.做RT前必需测RNA浓度，逆转录体系对RNA量还是有一些要求，常用500ng或1ug。2. RT按要求做，一般不会出太大问题。3. PCR，按常规。但如需扩长片段，则对前两步要求较高，需要有完整的cDNA存在，不是单改变Mg2+浓度、退火温度能解决的。1）RT和PCR时的引物设计是不是一定要先知道目的基因的序列？必须在RT时，引物设计有3种方法即a：Random 9mers；b ...

从组织中提取总RNA1)液氮研磨，组织块直接放入研体中，加入少量液氮，迅速研磨，待组织变软，再加少量液氮，再研磨，如此三次，按50-100mg组织/mlTrizol加入Trizol，转移入离心管进行第2步操作。2) 匀浆：组织样品按50-100mg/mlTrizol 加入Trizol，另外，组织体积不能超过Trizol体积的10%，否则匀浆效果会不好，用电动匀浆器充分匀浆约需1-2分钟。从细胞中提取总RNA1) 培养贴壁细胞：不须消化 ...

关于MSP，园子里的讨论帖子不少，但很多战友还是跑不出条带。此帖结合本人的亲身经历，就MSP提些建设性的意见，谨奉献给仍奋斗在一线的战友们。先简要的说说MSP法的原理，即用亚硫酸氢钠修饰处理基因组DNA，所有未发生甲基化的胞嘧啶（C）被转化为尿嘧啶（U）而甲基化的胞嘧啶则不变。设计针对甲基化和非甲基化序列的引物进行PCR，然后通过电泳图检测甲基化状态。本人研究的课题是一个常见的抑癌基因，前期的研究发现此基因的表达 ...

PCR定义PCR（Polymerase Chain Reaction）即聚合酶链式反应，是指在DNA聚合酶催化下，以母链DNA为模板，以特定引物为延伸起点，通过变性、退火、延伸等步骤，体外复制出与母链模板DNA互补的子链DNA的过程。是一项DNA体外合成放大技术，能快速特异地在体外扩增任何目的DNA。可用于基因分离克隆，序列分析，基因表达调控，基因多态性研究等许多方面。PCR技术的基本原理一.PCR反应成分：1.模板DNA； ...

我要得到的目的片段的序列如下：1: BD073420. Utilization of tr...OCUS BD073420 1266 bp DNA linear PAT 27-AUG-2002DEFINITION Utilization of transcription factor Brn-3a.ACCESSION BD073420VERSION BD073420.1 GI:22619023KEYWORDS JP 2001511344-A/2.SOURCE Mus musculus (house mouse) ...