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最近刚开始做PCR，参考了很多与引物设计相关的帖子，结合自己使用primer5和oligo的体会，想谈谈自己设计引物的方法和步骤，恳请各位前辈指正。RT-PCR引物设计原则和方法在NCBI上搜索到该基因，找到该基因的mRNA，在CDS选项中，找到编码区所在位置，在下面的origin中，Copy该编码序列作为软件查询序列的候选对象。打开Primer Premier5，点击File-New-DNA sequence, 出现输入序 ...

PCR技术讨论版的公共邮箱为：dxypcr@163.com ，备份邮箱：dxypcr@126.com希望战友在上传的时候，同时上传到两个邮箱，谢谢！（大小1G,最大附件30Ｍ）。点击此处去邮箱为了帮助新手尽快熟悉实验，为了方便大家上传及下载资料，我们借鉴蛋白版的宝贵经验，准备设立公共邮箱，欢迎大家踊跃利用邮箱上传及下载资料，战友在上传资料时，先确认公共邮箱中有没有，如果已有上传，原则上不予加分。有需要者ＰＭ与我联系索取密码 ...

PCR技术在分子生物学领域的重要性自不必多说，各种新的PCR技术也不断涌现。引物的设计是进行各种PCR的重要前提条件。虽然现在有很多软件可以设计并评价引物，但在实际的PCR扩增过程中，必须对反应体系和反应条件进行优化，尤其是引物浓度，Mg2＋浓度，退火温度等。有时候无论我们如何优化，也拿不到目的产物，只能重新设计。鉴于在引物的设计和合成过程中所花费的时间、精力和财力（尤其对于新手而言），本着资源共享的原则，建立丁香 ...

这是一本有关PCR技术的新书，希望会为你的PCR试验提供帮助！上篇PCR的基本理论与技术第一章 聚合酶链式反应分子克隆(molecular cloning)、DNA测序(DNA sequencing)和聚合酶链式反应(polymerase chain reaction，PCR)是当今现代分子生物学的三大主流技术。在这三种技术中，PCR技术在实践中的应用日益广泛并随着分子生物学实验技术的成熟而不断的创新和拓展。早在二十世纪七十年代 ...

一、实时荧光Taqman 探针设计总原则：探针选择要保守，引物选择要保守，因此必须找一段100-200bp相对要保守的片段来设计引物与探针。即real-time PCR的扩增片段是50bp----150bp。当找不到150bp的保守片段时，必须确保探针的片段是保守的。在设计探针和引物时，要同时考虑在两条链上设计引物与探针。但要注意的是：在那条链上设计探针时，就应靠近在同一条链上设计的引物(即上游引物)。这样，可保证在将来扩增时 ...

战友们，这个东东是我从网上搜来的，感觉不错！与大家分享！第一部分RNA 提取策略一、提取原理1、RNA降解的原因：内源性RNAase是造成RNA降解的最重要原因，因为人体细胞自身就是几十分钟（20min？）mRNA被降解一轮，所以不管是组织还是细胞还是液体状样本在离开其中细胞的最佳生活状态后都应该尽快的被妥善的方法保存起来。外源性RNA酶也是一个需要注意的因素，最常见的就是毛发尤其头发，灰尘，唾液，塑料手套这四个兄弟。 ...

Rt-PCR实验步骤一、实验器具与材料：1、移液枪：1ml、200μl、20μl、10μl、2μl2、吸头：1ml、200μl、20μl3、匀浆管：5ml4、吸头台：放置1ml吸头的一个，放置20μl吸头的一个5、EP管：1.5ml、0.2ml、100μl6、试剂瓶：2个60ml的棕色试剂瓶（广口，带盖）1个125ml的白色试剂瓶（放无水乙醇）7、量筒：50ml、250ml、500ml8、容量瓶：250ml、500ml、1000ml9、 ...

丁香园的长远发展靠的是专业兴园。本版独立建版，特诚征专业讨论组员，请大家踊跃报名。有了您的积极参与，本版会更出色！组员要求：凡是热爱DXY，经常参与本版讨论，对PCR及相关技术感兴趣并有一定专业基础的战友，学历不限，工作年限不限，总积分超过20分，本版积分超过10分，即可申请为组员。组员的权利：1、有价值的帖子加分，每5个在本板块得分的帖子（时间不限），（只包含专题讨论和回答问题的帖子、对本版专业建设提出非常有意义的帖子 ...

实时定量PCR完全手册方法简介所谓的实时荧光定量 PCR 就是 通过对 PCR 扩增反应中每一个循环产物荧光信号的实时检测从而实现对起始模板定量及定性的分析。在实时荧光定量 PCR 反应中，引入了一种荧光化学物质，随着 PCR 反应的进行，PCR 反应产物不断累计，荧光信号强度也等比例增加。每经过一个循环，收集一个荧光强度信号，这样我们就可以通过荧光强度变化监测产物量的变化，从而得到一条荧光扩增曲线。RT-qPCR是由三个步骤组成:1.反转录:依赖反 ...

做了好多DNA提取保存，吃了很多亏给大家点建议吧：（有疑问可以回帖，有时间我会回答如果我知道） 血液保存：EDTA抗凝最好，肝素也可以不过经常会影响后续试验，一般可以保存在-20和-80保存3-5年没有问题——保存时间越长似乎dna提取越少，再长时间我也没有试过，注意解冻一次大概损失20%左右（提取感觉估计得到的可能不准），放的时间长也会降解一些。4°做好不要太长3天我是试过没有问题再长不知道了血凝块就算了吧太难了结果不 ...

POST by Bingsen Xu前言：我是刚刚注册到丁香园，在PCR技术讨论版看见置顶贴，“请求助引物设计的战友先进来这里！”稍微浏览了一下，发现很多朋友对PCR引物设计还不是很熟悉，我愿意把自己积累的一点引物设计方面的经验和大家分享，希望不会做引物设计的朋友看完之后，可以不用再发求助贴而是自己动手做引物设计或者引物检验。开始之前：其实非常简单，不需要你下载任何软件，但是你得有一台电脑能上网。当然，最重要的是，你要很清楚 ...

园子里原来有关于这本书的帖子，采用56邮箱共享，均已失效，现在重新上传，申请版主加分：聚合酶链反应(PCR)自发明至今的20年来，经过不断的开发和改进，现在已经广泛应用在诸多领域，是分子生物学、临床诊断、法医检验等实验室的常规技术。　　本书是美国冷泉港实验室出版社PCR Primer：A Laboratory Manual第二版的影印本，是第一版的全面更新和升级。本书由从事PCR研究的专家们共同研讨和撰稿，是一部最新、最权威的PCR ...

PCR引物设计的11条黄金法则1.引物最好在模板cDNA的保守区内设计。DNA序列的保守区是通过物种间相似序列的比较确定的。在NCBI上搜索不同物种的同一基因，通过序列分析软件（比如DNAman）比对（Alignment），各基因相同的序列就是该基因的保守区。2.引物长度一般在15~30碱基之间。引物长度（primer length）常用的是18-27 bp，但不应大于38，因为过长会导致其延伸温度大于74℃，不适于Taq DNA ...

Q-PCR专栏：Q&A征集活动请大家仔细阅读下列规则！一. 活动目的：为广大战友提供Q-PCR入门知识和基本操作规范，互相交流，惩前毖后。二.活动规则：本活动是建立在旧贴整理的基础上，各位战友发贴前请先搜索本版。并回答下面所列问题。发贴须按下列格式进行，且“园内链接”一项必须详尽切题，否则不予加分。有技术方面的其他问题的战友，请另开贴求助。三. 发贴格式：问题题目：园内链接：问题回答：转自何处：四. 注意事项1. “问题题目”一栏需填写问题的 ...

前一段时间在百度中搜索，发现多年前写的一个关于荧光定量PCR技术的PPT有很多人看过或引用过，考虑到自己作荧光定量PCR工作已经了五年了，做的实验以及解决的问题远比五年前多了，因此利用过年的时间，写点荧光定量PCR实验中的一些注意事项及感想，无论对错，都是希望对相关的人员有些参考价值。荧光定量PCR原理等大家都已经很熟了，我就不细说了，主要是写一些有人问过的事，希望写的内容是大家都关心的。普通PCR与荧光定量 ...

PCR讨论总结(PCR、RT-PCR、REAL-TIME PCR本版置顶贴汇总)http://www.dxy.cn/bbs/post/view?bid=67&id=686472&sty=1&tpg=1&age=0PCR的基础知识http://www.37c.com.cn/topic/004/genediag/http://210.83.8.237/us/tech/tech01.asphttp://www.dxy.cn/bbs/post/view?bid= ...

由于原来的共享平台技术故障，现将共享资源放入新建的信箱。一个好的平台需要大家共同来维护，所以有一些要求，请大家遵守。1.请勿修改登陆密码。2.请勿对外传播本邮箱地址，以及登陆密码。3.请勿更改、删除其中的文件内容。4.有任何问题，请到丁香园PCR技术讨论版相应版块求助。5.为了避免由于访问量和下载量的原因导致信箱被锁的情况发生，请各位站友控制自己单位时间内的下载量。公共信箱：dxypcr_share@126.com密码： ...

基因表达之RT-PCR之我见在论坛上看到不停地有人在问RT-PCR的问题，实际上在以前的帖子中各位香主和eeflying（我为什么总是提他们？因为还是很佩服的哦，生怕自己说错了，被他们指出来哦）都谈到了很多，鄙人也充大头答了一些问题，但是还是有各种问题，由于的基因表达还有点实战经验（但也技止此而），所以想些点东西给大家参考，计划把包括RNA酶保护分析，northernblot，原位杂交，半定量RT-PCR和定量RT- ...

最近楼主才回来，由于很长时间不做这方面的工作了，很多新概念和新方法可能跟不上大家了，说的不对请见谅啊。感谢大家的踊跃发言。最近看到很多战友在做miRNA的荧光定量PCR检测试验。也没看见有专门的讨论帖，拿自己以前做的试验晒晒。开个帖子欢迎大家来提问题、讨论。 另外希望各位战友有用没用千万看贴回个贴阿，以免此帖沦丧无尽之海。:D:D:D:D 目录如下：一、MiRNA简介二、反转录引物分类以及设计原理三、引物探针设计四、试验操作 ...

RT-PCR原理http://www.dxy.cn/bbs/actions/archive/post/130889_0.htmlhttp://www.invitrogen.com.cn/Focus/Focus24/Focus24_Top.htmRT-PCR基础http://www.dxy.cn/bbs/actions/archive/post/338601_0.htmlRT－PCR flashhttp://www.bio.davidson.ed ...