zhangyuxianggx 各位大侠好！现有pcDNA3-mCherry和pGEM-hgene两个东西在滤纸上，老师就说让构建载体，具体是什么意思啊？我理解的是一个真核表达载体和构建好的pGEM质粒，但是不知下一步该怎么做？恳请各位好心的大侠指点一二。shylook 直接插入cDNA吧zhangyuxianggx 那个pGEM就是已经插入了DNA的载体。请问这两个东西溶下来以后要怎么保存zjubell 剪下来。TE融解，再 ...
wori1123 我的研究课题需要动态观察细胞内钙离子浓度，大概每隔10秒观察一次，想跟大虾们请教下怎么样能解决连续观察时温度的恒定问题，因为试了好多次都不行，谢谢DarrenWONG 您要观察多久？几分钟？几小时？用Fluo-4的Flexstation 或 Flipr （Molecular Devices公司）可以实时检测细胞钙流（比如加药后），可以控制温度、湿度，但是读出来的荧光信号，没有图像，而且细胞检测后就废了。显微镜观察的话，用 ...
尘朵朵 请问用过transwell小室的战友们，你们用它种细胞时的密度+时间是多少啊（加药之前）。我每次也没计数，就是一个25cmXcm的培养瓶，长满之后消化，每个小室种250ul细胞，一共12个小室，长至第二天约16小时。不知道是否太满了？请各位提出宝贵意见哈！先谢谢了！ciliary 你好，我每次都是计数的，养的是HUVEC，每孔细胞数为5×10^4，每孔是100ul，一般测迁移，6-8小时就可以了，我最长做过24小时，觉得 ...
小猪爬墙 各位大虾好，想请教大家下信号通路的实验怎么设计，我的实验是已发现基因A可调节癌基因B的表达，基因A下调可以使癌基因B表达降低，同时某miRNA可以下调A基因表达，能否设计实验通过人为上调某miRNA下调A基因表达，进而使得癌基因B表达降低呢？请教是否可行？我看通路设计中一般都需要敲除中间的某个基因以验证其作用，我的实验设计中上调miRNA后检测基因A然后检测基因B表达，实验中是否需要敲除基因A然后再检 ...
suiyuanjiuzhu 转染的话不就改变了细胞本来的表达量了吗xujian2004265 你不是要检测你的外源基因的表达吗？加我QQ24289096suiyuanjiuzhu 老板一定要我做蛋白 把mRNA让另一个人做了郁闷啊本文由丁香园论坛提供，想了解更多有用的、有意思的前沿资讯以及酷炫的实验方法的你，都可以成为师兄的好伙伴师兄微信号：shixiongcoming
llh刘丽华 各位好：我做了1个多月western blot了，内参跑得还可以，但是目的蛋白总是跑不好，今天跑出来非特异性条带很清楚，而目的条带却很淡，不知是什么原因！前一次也是这种情况，我就延长封闭时间至2h，一抗1:700，二抗1:5000，请各位高手帮忙分析一下吧！下面是我的图片，最下面，模糊的一条（靠图片中间的一条）是我的目的条带！coffeeshine 如果非特异带很清楚，延长封闭时间没作用。你的目的蛋白和一抗的关系是 ...
yaoyao82986 想请教一下关于长链非编码RNA的基因多态性（SNPs）的研究方法，如何从已知的lncRNA中选择SNPs位点（pubmed数据库中好像很多lncRNA都没有多态性信息）？非常感谢各位啊！霍一刀hxs 将查询到的lncRNA序列输入http://genome.ucsc.edu/网站中的Blat选项，点击submit，再选择browser,图表中会出现SNPs位点。接下来就可以做SNPs分析了。wils ...
superskyfly 我自己都觉得我自己很牛，千百人都做出来的试验，我就是做不出来。质粒用的是Promega p4.32-NF-kB-Luc, 转染用的是Invitrogen的Lipofactamin, 激活用的是Sigma生产的PMA和PHA-P,Assay用的是Promega dual,结果加了PMA和PHA的和不加的读数几乎没有区别。加了compound的和不加的也没有区别。用过PC3, Jurkat, A549，HCT116都是一样 ...
tu_guiyun98121 各位大侠好。本人准备做转染细胞，用的试剂是invitrogen的lipofectamine 2000。因为是初次做，有几个问题想请教一下各位高手。谢谢！1。质粒DNA抽提完后（用除内毒素试剂盒），是否需要除菌。如果需要，一般用什么方法？2.如果是做瞬时转染，是不是可以不用线性化质粒，而是提完质粒就可以直接用于转染。如果是稳定转染，就要先酶切质粒，使其线性化，然后再转染。3.invitrogen的l ...
大鹏鸟 做microRNA反转录，查文献用到的是如下引物：5′-GCGAGCACAGAATTAATACGACTCACTATAGG(T)12Vundefined-3′，V_~L_A~E_G~E_C~J_N_~L_A~E_T~E_G~E_C.请问订购这样的引物应该怎么跟公司说啊？是就这么说呢，还是应该排列组合把所有可能的序列都告诉他？freecell 你只需要把序列这样递交给人家，合成的人懂的。在备注里说明一下V和N是什么。至少我在IDT和sigma就是这样递交的。价格都是按照碱基个数、合成规模、纯化 ...
xiaozhangwei2 做的病毒。被指定了一个新方向，假设X病毒可以诱导P53的翻译后修饰，使其不再与靶基因结合。应该设计哪些实验来验证呀？ （病毒诱导的P53翻译后修饰种类可能为磷酸化或者乙酰化，不确定。）完全没有信号传导方面的经验，还请多多指教。希望可以简短的把所需要做的实验罗列一下,怕自己是新手，考虑不周全。谢谢！大鹏鸟 1、X病毒诱导后，用磷酸化或者乙酰化抗体检测P53的变化。2、X病毒诱导后检测P53-Lucif ...
xiaozhangwei2 P53的翻译后修饰都有哪些？听说有磷酸化和乙酰化。还有其他的吗？怎样找出P53是发生了哪种修饰变化？如何设计实验验证P53修饰后，与靶标启动子结合时，有没有产生结合活性的变化啊？谢谢！大鹏鸟 p53的修饰正常细胞在非应激状态下p53的水平和活性都较低，受到应激作用时，p53通过一系列的翻译后修饰被活化，并能结合特异的DNA序列。翻译后修饰是调节蛋白质功能的一个主要机制，p53在多个位点上可 ...
xthuangsui 小弟在做RT-PRC。样本来是SD雄性大鼠附睾精子悬浮液。这样的样本应该如何处理，提取RNA。飘渺的虫 普通用trozl法提取rna就可以吧，感觉上没有什么困难啊，主要是量要尽量一致大鹏鸟 先离心把精子沉淀下来，1000-4000转都可以，低转速精子活力更高点，然后再提取，按trizol说明书进行。或者可以用提取血液RNA的试剂盒来提取。qiagen有。ffly 可以用qiagen的RNeasy Kit系列来做 ...
心灵交流 本人想请教高手：在westernblot中煮样时需不需加上loading buffer后再煮样？以及loadingbuffer和样加的比例如何定？如6Xloadingbuffer加到样中的量如何定？谢谢zhong_cq 那是要加LOADING BUFFER, 6X的上样缓冲液，那样本与BUFFER之比为5：1（V/V）。coffeeshine 和做SDS-PAGE一样，加多大浓度、多少量的上样缓冲液视样品的浓度而定。selle ...
xiaorui3510 敢问各位大侠怎么利用两种基因的同源序列来设计引物，比如说我用人源Mcl-1基因序列和褐家鼠源Mcl-1基因序列两者的同源序列来设计引物？希望不吝赐教！呵呵万分感谢。。。dolphin_705_200 你是想设计一对引物对两种种属的基因进行检测是吧。先将两个基因的序列进行同源性分析，然后在差异较小的区域设计引物即可。PCR时有几个碱基不匹配没有关系的，但是要注意，这些不匹配的碱基尽量不要在引物的3' ...
ilovelc999 请问各位，提质粒后，用20微升TE溶解，然后进行电泳，应该用10乘Loading Buffer 还是用6乘Loading Buffer？另外Buffer与质粒溶液一般应以什么比例混合好呢？多谢各位啦！纯属菜鸟 10乘 5：1的比例 质粒5肥宝 我是用6X的，1:5，质粒5，不过也没那么严格，一般也就点个小点估计1ullihuijin017 都可以，按比例就好！没那么严格ilovelc999 恩恩，多谢各位了！本文由丁香园论坛提供，想 ...
wangch84 各位高手，兄弟最近忙于质粒构建，意图将一段长约4000 bp的片段，通过BamH1和EcoR1两个酶切位点连接到pcDNA3.1+载体上。情况如下：1. 通过LA Taq酶扩增，并纯化回收目的片段（引物中带有酶切位点，保护性碱基＝3，上游带有Kozak序列）；由于回收效率很高，所以在进行下一步双酶切时只加了12 μl的目的片段，H2O 20 μl，10 X K BUFFER 4 μl，两种酶各2 μl，37℃作用过夜（12-14 h），再进行胶回收。2. 载体pc ...
ilovelc999 很着急，不知道10mmol/L的Tris-HCl(pH8.0)如何配制？有哪位知道吗？麻烦告诉我一下好吗。mybbff 先配成10mM的，水先不要加足，调节pH到8.0后再定容到预定体积。ilovelc999 恩，知道啦，多谢版主！wangbingying66 1.称取1.211g Tris2.加800ml去离子水，充分搅拌溶解3.加420μl HCL4.加去离子水定容至1L5.高温高压灭菌注意：应使溶液冷却至室温后再调P ...
zhoujianheng 哪位大侠有较完整清晰的PI3K/Art信号通路图，谢谢chengbin1217 爱玩的小瓶子 共同学习吧 加油guojunling1201 你好！你找到了吗、能不能发给我一份？大水牛11678 guojunling1201 wrote:你好！你找到了吗、能不能发给我一份？冷枫之孤独王者 cell signaling technology上有本文由丁香园论坛提供，想了解更多有用的、有意思的前沿资讯以及酷炫的实验方法的你，都可 ...
qiangshou2010 我最近转染Frhk-4细胞株，用QIAGEN和lipofectamine 2000/RNAiMAX都不能将siRNA转进去。前几天用了Engreen的一个试用装，感觉是转进去了，但是老师说不一定。siRNA荧光和细胞不像是在同一平面？下面是图，大家帮忙看一下，谢谢。qiangshou2010 我观察前用pbs将细胞洗了两次，这个过程能不能将细胞膜上的siRNA洗掉呢？芦宏 我建议你看一下转染效果，做 ...
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