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夜色星辰1234 我是一个新手， western前后做了两次，均是在130-150之间出现信号很强的非特异性条带，另有少许杂带，而B-actin处信号很弱（原则上说，应在膜的中下近1/3处出现特异性条带），但却几乎看不出来（下图所示），请高手指点，不胜感激！aids610610 上样量一样吗？夜色星辰1234 aids610610 wrote:上样量一样吗？上样体积均是20ul,蛋白定量均是45ug.每次上样之前均先在沸水中煮了5min, ...

流产 请教各位高手，我初涉信号转导方面的实验，想用EGFP表达一段编码信号蛋白的真核序列，这样就会使GFP蛋白和信号蛋白融合在一起，好处是转染的时候比较方便，不用大量的做验证工作，但GFP蛋白相对较大，我担心GFP蛋白会影响信号蛋白的空间结构，使得不能发挥正常的生物学功能，请教有经验的高手，有什么建议？请赐教paroxysm 融合蛋白可能会影响目的蛋白的亚细胞定位这也是标签蛋白为什么都很短的原因之一大鹏鸟 标签蛋白太大 ...

zhangyuxianggx 各位western达人，本人在western操作中屡次失败，现有几个问题跟达人们请教一下：1、我的蛋白是96kDa,选择8%的分离胶有没有问题？2、配制浓缩胶我用的是0.5M Tris-HCL(PH=6.8)，但是看到好多配方用的都是1.0MTris-HCL(PH=6.8)，这个有没有什么影响？3、转膜是用的300mA,40min，看着转膜后胶很干净，就一直用的这个电流和时间。但是最后膜上总是很乱，背景高 ...

lope 请教各位大侠：购买的UPSTATE的TOPFLASH/FOPFLASH质粒，准备做双荧光素酶报告基因检测，看文献上都只是用这个质粒和Renilla的载体共转染细胞，是否这个质粒本身就携带了Firefly萤光素酶呢？我看了说明书，只是说two full and one incomplete copy of the TCF binding site (mutated) followed by three copies in the reverse orientation, upst ...

xiangcate 做动物血管免疫组化结果显示药物能抑制nf-kb通路，并下调MCP-1的表达，但对同样是nf-kb通路下游的IL-8，ICAM-1没有下调作用，如何解释？谢谢！xiangcate 有人知道吗！microlabm300 可能IL-8有其他通路的串话调控paroxysm 很正常。严谨的话，需要染色质免疫共沉淀来确定NFkappaB的下游基因的调控。xiangcate paroxysm wrote:很正常。严谨的话，需要染色质 ...

wgqsdams 各位高手，我们想做miRNA的实验，通过qPCR的方法验证，现在我们自己有引物序列，想找个便宜又有保证的公司进行引物茎环部分的序列设计和合成，请各位高手给指点迷津。谢谢！！masmas 我合引物一般去上海英骏godsay5605 同样推荐英骏，我们合引物也是去他们家epdnge 广州锐博生物可以86964109 最近用上海生工合的，还可以本文由丁香园论坛提供，想了解更多有用的、有意思的前沿资讯以及酷炫的实验方法 ...

Drnw 我在紧接翻译区后的3‘UTR区发现一个突变，但如何预测3‘-UTR区的突变是micoRNA结合位点，并与基因的表达有关。急求！！万分感谢！！lide658 把这个基因的名字输入到microrNA预测软件中，然后看你所发现的突变位置是否有microrNA结合，然后再看是不是突变位于种子序列中，如果是可以进一步研究突变与否是否会影响microrNA的结合，进而影响到基因的的表达。Drnw lide658 wrote:把这个 ...

dongfangzhizi06 我要做信号通路(ERK和p38)，请问多少数量的细胞可以提磷酸化蛋白做western blot检测p-ERK1/2和p-p38？六孔板的一个孔够吗？谢谢！民间恺撒 上次我接板时的密度是5×105，提了四个孔的总蛋白，大概浓度在8.5左右。建议6孔板可以使用两个孔叠加在一起，这样蛋白浓度会有所保证。bianbenjamin 我都是六孔板一个孔做的，为了保证蛋白浓度，少加点裂解液即可，我一般是60-80微 ...

wangch84 最近要构建miRNA的表达质粒，要设计引物从基因组中扩增目的基因，发现一些文献里设计引物时用的模板序列是基因组DNA模板序列的反向互补序列，不知具体原理，请赐教。大鹏鸟 DNA是双链啊，PCR扩增出来就都包括了wangch84 to大鹏鸟，有些miRNA位于正链，有些位于负链，具体原理找不到liangpz 这个跟载体有很大关系，取决于载体promoter的方向。如果载体promoter是反向的话，就是这样了 ...

xun梦中 各位大侠好，想请教一下，DNA跑完琼脂糖凝胶电泳，EB染色之后还能做切胶回收吗（排除毒性问题）？在此先谢过各位侠们了啊hdlhq 可以 没有问题shylook 就是得EB染色后你才能看到条带切胶回收呀。。。xun梦中 恩，用Loading buffer作指示的话就得染色。先谢过了啊本文由丁香园论坛提供，想了解更多有用的、有意思的前沿资讯以及酷炫的实验方法的你，都可以成为师兄的好伙伴师兄微信号：shixiongcoming

dongfangzhizi06 打算培养成骨向诱导BMSCs，请问：诱导剂是溶于培养基中保存（4度和-20度）呢，还是单独保存每次用时再混于培养基中呢？如果是后者，又该在什么温度下保存？dongfangzhizi06 自己顶一下！ruiteluoshuixiu 我觉得是要单独保存啊，如果混了的话，容易影响效果的dongfangzhizi06 谢谢！本文由丁香园论坛提供，想了解更多有用的、有意思的前沿资讯以及酷炫的实验方法的你，都 ...

summer027 各位站友，小弟打算做干预手段对Akt、TSC1/2、Rheb、mTOR、4E-BP1、P70S6K、AMPK磷酸化表达的影响，不知道有没站友知道做这样的实验大概要花多少钱呢？主要是试剂方面的。另外，请问判断mTOR信号通路的变化是用磷酸化表达还是用mRNA表达来反映更好呢？请各位大大指点！！！谢谢！！！zhibinx2007 试剂主要是磷酸化抗体，每种大概3-4000左右，做mTORx信号通路主要是用AKT ...

yolanda2122 我正在一个人源细胞的PCR，需要设计GADPH和LOX-1,THF-a,IL-1,IL-6,我用PUBMED搜出来的有些有好多选择，不知道该用哪一个啊，有没有高人指点一下，第一次做，完全没概念，谢谢zjubell 还是直接找以前的文献吧，人的么，大部分都有人做过了。http://www.rtprimerdb.org/http://pga.mgh.harvard.edu/primerbank/当然自己设计更能增长 ...

longchi 近来看了一些文献，被CDNA有关东西弄迷惑了，请求帮助解惑。1、cDNA是以mRNA为模板，经反转录酶催化，在体外反转录而成，其组成特点是其中不含有内含子和其他调控序列。有文献说“分析XX的cDNA可发现它有一个很长序列的3“ 非编码区域”，既然cDNA不含内含子和其他调控序列，为何还有非编码区域呢，非编码区域不属于内含子或调控序列吗？2、某基因有外显子1含362个BP，外显子2含150个BP，外显子3含1 ...

穿越之后叫小丫 新构建的质粒抽提后跑PCR能跑出我的目的条带，但是酶切验证时却没有我要的片段，我把扩增目的片段的引物和原始质粒做了比对并没有互补序列啊，这是什么情况呢？电泳图在附件中，请各位大侠帮忙解解惑啊！谢谢！济南基美 可能是引物中污染了模板或者是酶切不成功ylong12 看下你构建载体时的酶切时间 时间太长 易产生星活性 这样的话 你PCR结果没错 但是你就切不开了穿越之后叫小丫 济南基美 wrote:可能是引物中污染了模板或者是酶切不成 ...

lixingliang1987 我的实验流程是：先扩增带有Flag标签的基因，再转进293T细胞进行表达，然后做western验证蛋白表达情况，但是发光后却出来好几条条带，十分困惑，请大家帮忙看看，图片附上。第一幅图是内参GAPDH，第二幅图是我的目的蛋白。lixingliang1987 自己顶一下BioGao 一抗孵育有问题吧。。。本文由丁香园论坛提供，想了解更多有用的、有意思的前沿资讯以及酷炫的实验方法的你，都可以成为师 ...

小红赛 Lentivirus shRNA-mediated Knockdown of NF-2FG12 lentiviral vector, with an independent open reading frame of green fluorescence protein (GFP), was used to produce small, double-stranded RNA (siRNA) to inhibit target gene expression in targeting cells. To construct the hairpin s ...

绣面芙蓉 如题，细菌做DGGE一般是用16S，真菌的有没有，ITS还是18S，GC夹要用什么，加在哪里，上游引物前还是下游引物前？我找过很多文献都没有找到完整的，如果能给出序列（包含GC夹）或者给出相应文献，丁当就奉送。zjubell FUNGI - UNIVERSALNameRegionFragment SizeSequence (5' to 3')ReferenceITS118S570–590TCCGTAGGTGAACCTGCGGWhite et ...

如来的观音 如题，谢谢zjubell 建议先google一下，至少有些基础的认识。原理其实很简单的，用一个带loop的引物去做逆转（单链也行，但带loop的效率会高一些）然后正向引物是特异性引物，反向引物其实是一条通用引物，与loop结合的。再用普通的sybr green直接定量PCR即可。一个样本，一个miRNA几百元其实比较贵了。提RNA，逆转，引物，我觉的50块钱么差不多了。当然，人力比较值钱。wangke80 费用还取决于 ...

liuruya 问别人要了个带GFP-tag（GFP-N2载体）的质粒，目的基因1.4kb，分子量约52kD，转染293T细胞能见荧光，WB杂不出来，设置了阴性和阳性对照证实不是WB的技术问题。后来又换了个flag-tag，仍然杂不出来WB。仔细检查过序列，不存在移码的问题，非常费解。有同学分析是空间位阻问题，不知换个tag是不是能解决这个问题。有同学遇到过这种问题么，或者帮忙分析一下可能的原因。谢谢！！！zhuqueleee ...