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通过将目的基因包装成病毒来感染细胞，使目的基因得到表达，从而满足实验需求。悬浮培养适用于一些非粘附性细胞系。此为正式实验前的预实验。

与细胞冻存对应，是指将冻存在液氮或者 -80℃ 冰箱中的细胞温和解冻后，重新使细胞回复生长，进行培养和传代。

细胞冻存是细胞长期保存的主要方法之一，通过将细胞储存在冻存液内，再放置于 -80℃ 冰箱或者液氮等低温环境中，减少细胞代谢，起到细胞保种的重要作用。

通过将目的基因包装成病毒来感染细胞，使目的基因得到表达，从而满足实验需求。贴壁培养适合大多数细胞类型，包括原代培养。

通过将目的基因包装成病毒来感染细胞，使目的基因得到表达，从而满足实验需求。贴壁培养适合大多数细胞类型，包括原代培养。此为正式实验前的预实验。

蛋白质组作为重要的科研技术，广泛应用于科研中，在每年数万篇论文中发挥重要作用。如何利用组学工具快速切入临床科学问题形成科研思路，为我们的研究提速？可参考以下三种研究思路：6.1、IF 1-3 分文章：蛋白质组学+差异蛋白蛋白质组学检测筛选差异蛋白进行表达量验证分析差异蛋白，对差异蛋白进行 GO 和 KEGG 分析6.1.1、案例一，影响因子 IF=2.2iTRAQ-based quantitative proteomics analysis of immune thrombocytopenia patients before and after Qishunbaolier treatment.科学问题：确定齐顺保利尔（QSBLE）治疗免疫血小板减少症（ITP）的潜在治疗靶点。 研究内容蛋白质组学：利用蛋白质组学对 ITP 病患者（对照 3 重复，治疗有效、无效病人治疗前后各 3 重复），治疗在 QSBLE 治疗前后的蛋白质表达差异进行分析。与对照组相比，共鉴定出982种差异表达蛋白。与治疗前相比，治疗后 61 种蛋白表达差异，其中 48 种蛋白显著上调，13 种蛋白下调。29 条差异途

随着药物的发现和开发，动物活体光学成像，如生物发光成像（BLI）和荧光成像（FLI），被用于研究各种疾病过程中细胞和分子事件的发生。其中，C57BL/6 小鼠是转基因小鼠建模的首选，但由于它们的毛发颜色较深，成像前需要通过剃毛或化学脱毛来去除毛发，以便最大限度地收集信号。然而，脱毛会破坏正常的毛发生长周期，导致皮肤色素沉着的变化。C57BL/6 毛发生长周期由三个阶段组成：静止期，皮肤为淡粉色；活跃期，皮肤变为深灰色或黑色；成熟期，毛发停止生长，皮肤过渡回静止期，恢复为淡粉色。皮肤色素沉着是生物发光成像中的一个重要变量，在纵向研究的实验设计和实施中应该考虑到该变量，特别是当需要对弱信号变化或动物之间的差异研究时。由于黑色素的吸收系数随波长的增加而降低，黑色素对较短波长（即在可见光谱中）的光的吸收作用比在近红外波长的光对更强。荧光成像可以使用近红外染料，它们具有较长波长的发射光谱，使它们对黑色素吸收的敏感性较低。然而，生物发光成像并不具备这个优势。萤火虫荧光素酶的发射峰约为 560 nm，使生物发光信号从与其相互作用的组织产生显著的散射和吸收效应，进而改变了从动物身上产生的信号的强度和分

荧光成像被广泛应用于生物学的各个方面，允许可视化的细胞和亚细胞生物过程的空间分辨率范围从纳米（nm）到厘米（cm）。动物体内荧光成像已成为临床前工作中最常用的检测手段之一。在考虑体内荧光成像在生物学研究中的应用时，研究人员应注意其内在的局限性。在某种程度上，这些限制与光与组织微观成分的相互作用有关。如：界面反射、散射、吸收和自发荧光等。体内荧光成像中，组织散射和吸收可以显著影响荧光团的测量光谱。组织散射：当整个动物被激发光照射或透射时，在激发光进入动物体和荧光团发射光的过程中经历了多次散射事件。这将会导致在荧光图像中出现信号模糊的情况，这种情况对于远离激发光源和探测器（CCD）的荧光目标会被放大。散射的另一个重要结果是，它放大了组织荧光团的波长变化，导致检测到的荧光光谱的形状和峰值位置根据组织中光所走过的路径长度而变化。 组织吸收：组织内的微观成分从小分子（糖、脂肪酸、氨基酸、核苷酸、离子、水等）和大分子（蛋白质、磷脂、RNA、DNA、多糖等）到更大的结构（如细胞器和细胞膜等）通过可见光波长范围（400-700 nm）时，因为组织成分在这个波长范围内的吸收限制，削弱了有效光的穿透。然而

越来越多的研究显示，通过纳米技术将免疫检查点阻断疗法（ICBT）与其他治疗方式相结合，为进一步提高免疫力，并有效地治疗癌症提供了机会。例如，中国药科大学王伟教授团队以 A minimally designed PD-L1-targeted nanocomposite for positive feedback-based multimodal cancer therapy 为题，在《ELSEVIER》发表研究论文。该研究利用自组装光热剂黑磷纳米片（BPN）、化疗剂聚二甲双胍（PolyMet）和免疫检查点抑制剂——抗 PD-L1 抗体（aPD-L1），通过桥接PolyMet 和 BPN 之间的静电相互作用，避免了 BPN 降解，制备了三和一 PD-L1 靶向的纳米复合材料（NC）。研究制备的 aPD-L1-PolyMet/BPN NC 可以通过基于 ICBT 的 aPD-L1 与 PD-L1 的相互作用精确靶向原发性肿瘤，由于光热治疗（PTT）后 PD-L1 在肿瘤部位的上调，靶向效果逐渐增强，确保在连续治疗循环中实现正反馈介导的多模式抗肿瘤作用。此外，光热免疫治疗（PIT）、化疗和 I

上文中提到叶绿素，可能大家会觉得很奇怪，动物体内为什么会由叶绿素呢？其实，常规啮齿动物饲料中含有大量的紫花苜蓿，苜蓿中含有叶绿素。由于叶绿素及其代谢物聚集在肠道中，因此在小鼠腹部能够观察到较强的自发荧光，峰值波长约为 680 nm。肠道的自发荧光可能会掩盖定位于腹部或腹部附近的荧光探针的信号，也可能模拟探针在肠道中的排泄和/或积累。不同成像条件下，不同饲料的自发荧光对比图(Inoue Y, Izawa K, Kiryu S, Tojo A, Ohtomo K. Diet and abdominal autofluorescence detected by in vivo fluorescence imaging of living mice. Mol Imaging. 2008 Jan-Feb;7(1):21-7.) 上图为测定每种食物颗粒的荧光强度。纯化饲料（purified diet）在绿色区域荧光最强，其次是无苜蓿饲料（Alfalfa-free diet）和常规饲料（regular diet）。相比之下，远红光和 NIR 区荧光最强的是常规饲料，无苜蓿饲料荧光较弱，纯化饲料荧光最

动物活体荧光成像实验中，一般利用荧光蛋白选择性地标记目标细胞，或用荧光染料标记药物，再通过活体成像系统进行详细观察。但是在荧光成像过程中，当观察目标的荧光信号微弱时，自身荧光会干扰目标荧光的识别。自发荧光是指由细胞结构或代谢产物等产生的自然荧光。从小分子（糖、脂肪酸、氨基酸、核苷酸、离子和水等）和大分子（蛋白质、磷脂、RNA、DNA 和多糖等）到更大的结构（如细胞器和细胞膜），覆盖了大部分可见光谱范围（400-700 nm）。自发荧光与标记物发射波长重叠的时候，经激发光照射会发射出与标记物相似的荧光波长，导致低信噪比，检测灵敏度受限，在某些情况下甚至根本无法检测或显示标记物荧光。例如，比较常用的标记物 GFP，其最佳激发波长为 470 nm，最佳发射波长为 509 nm。在被 470 nm 激发光激发，会发射出波长 509 nm 为主的绿色荧光。另一方面，生物体内普遍存在的胶原蛋白和弹性蛋白也会发射出>515 nm 的自发荧光，对标记物的检测造成了一定的干扰。因此，掌握不同物质的光谱信息，对清晰地观察实验动物体内标记物尤为重要。自发荧光来源信息表(Billinton N, Kni

目前，在荧光素底物中，D-荧光素和腔肠素使用得比较多。不同的底物应采用不同的注射方式。D-荧光素可通过尾静脉注射（IV）或腹腔注射（IP）。然而，腔肠素因其会被血液中的氧气氧化，产生较高的背景荧光，所以只能通过 IV 的方式注射到实验动物体内。对于 D-荧光素来讲，IV 和 IP 同样会影响生物发光的结果。IV 与 IP 比较结果图(Keyaerts M, Verschueren J, Bos TJ, et al.. Dynamic bioluminescence imaging for quantitative tumour burden assessment using IV or IP administration of D: -luciferin: effect on intensity, time kinetics and repeatability of photon emission. Eur J Nucl Med Mol Imaging. 2008 May;35(5):999-1007.) 左图为在同一只小鼠上尾静脉注射和腹腔注射 D-荧光素后的生物发光图像。右图为不同

荧光素酶的发光是酶促反应产生的自发光，不需要激发光，但需要底物荧光素。不同的荧光素酶所需的底物不同。例如，萤火虫荧光素酶的底物是 D-荧光素，海肾荧光素酶的底物是腔肠素。其中，D-荧光素的使用频率最多，荧光素在氧气、ATP 存在的条件下和荧光素酶发生反应，生成氧化荧光素，并产生发光现象。目前市场上 D-荧光素主要有三种形式，D-荧光素（游离酸）、D-荧光素（钠盐）和 D-荧光素（钾盐）。这三种形式主要区别在于溶解特性，配成溶液后，其在绝大多数应用上都没有实质性的差别，整体来看，钾盐在活体成像中的应用文献明显多于钠盐和游离酸。D-荧光素的发光动力学与注射 D-荧光素的浓度关系不大，需要根据动物体重进行注射，大部分已发表的文献中使用的荧光素浓度是 150mg/kg。

生物发光是一种依赖于酶和底物的相互作用来产生光的化学过程。所需的酶被称为荧光素酶，底物因荧光素酶的类型而不同（如荧光素）。常用荧光素酶信息表：其中最有代表性的是来自萤火虫体内（Firefly）和海肾（Renilla）体内的两类萤光素酶，分别命名为萤火虫荧光素酶（FLuc）和海肾荧光素酶（RLuc），同时近年来研究得较多的是来源于高斯氏菌的高斯荧光素酶（GLuc）。萤火虫荧光素酶（FLuc）作为最通用和最常见的报告基因，该蛋白质不需要翻译后修饰即可获得酶活性，可用于原核和真核细胞。FLuc和其它甲虫荧光素酶是分子量相对较大的酶，分子量大小约为 60kDa，底物为 D-荧光素，需要辅助因子 ATP 和 Mg2+。FLuc 发出的是黄红光，发射光峰值为 560nm。海肾荧光素酶（RLuc）是一种从 Renilla reniformis 分离的分子量大小为 36 kDa 的荧光素酶。与 FLuc 相比，海肾荧光素酶的底物和辅助因子需求不同。RLuc 在氧气存在下催化腔肠素，产生 480 nm 的蓝光。海肾萤光素酶因其与 FLuc 在底物要求和光输出方面的差异而可用于双重报告检测。近年来，因为其它

X射线（X-ray），又被称为伦琴射线或 X 光，是一种波长范围在 0.01 nm 到 10 nm 之间（对应频率范围 30 PHz到 30 EHz）肉眼不可见的电磁辐射。X 射线之所以能使实验动物在荧屏或胶片上形成影像，一方面是基于 X 射线的穿透性、荧光效应和摄影效应；另一方面是基于实验动物组织有密度和厚度的差别。由于存在这种差别，当 X 射线透过实验动物各种不同组织结构时，它被吸收的程度不同，所以到达荧屏或胶片上的 X 射线量即有差异。这样，在荧屏或X射线上就形成黑白对比不同的影像。X 光成像示意图 优点：穿透性强，直接定位成像，从而更好地分辨动物内部结构图像，大幅提高了研究的准确性。弥补光学成像只能二维平面成像，空间分辨率小差的缺点（3D成像）。不足之处：X光有辐射风险，对设备的设计要求较高。X光成像效果图X光成像和发光成像叠加图

荧光是自然界常见的一种发光现象，通过激发光进行激发，进而发射出比激发光波长长的发射光。荧光成像的理论基础是荧光物质被激发后所发射的荧光信号的强度在一定的范围内与荧光物质的量成线性关系。荧光成像系统包括荧光信号激发系统（激发光源、光路传输组件）、荧光信号收集组件、信号检测以及放大系统（CCD、PMT）。 实验原理：荧光成像的标记方法有两种。一种是荧光蛋白的标记方法，与生物发光类似，将荧光蛋白基因作为报告基因，连接于启动子下游，稳定整合到细胞染色体内。另一种则是荧光染料标记好细胞或药物分子后注射到动物体内。标记后，在外界激发光源的激发下荧光物质在生物体内以发射光的形式表达，进而监控生物体内的细胞活动和基因行为。通常情况下荧光成像的特点是，短波长和高能量的激发光激发，发射出长波长和低能量的发射光。例如：标记物 GFP 的荧光基团在一束特定波长（如 430nm）激发光的作用下，荧光基团的电子向高能级跃迁，随后从高能级跃迁回较低的能级，释放特定波长的光（如 500 nm）。 优点：荧光标记物选择性更多，荧光蛋白、荧光染料、量子点及各种纳米荧光颗粒均可以作为标记物标记方式更灵活，荧光蛋白可以标记基

上转换荧光是指稀土离子吸收两个或两个以上低能光子而辐射一个高能光子的发光现象，通常是近红外光转换为可见光。上转换荧光成像技术（up-converting phosphor technology，UPT）是基于上转换发光材料而发展起来的一种新型标记技术。上转换颗粒 UCP 是由数种稀土金属元素掺杂于某些晶体的晶格中构成的颗粒。由于其独特的结构，这种材料可在红外光区（波长>780 nm）被激发，发射波长远短于激发光的可见光（波长为 300~750 nm）。上转换荧光成像示意图(陈敏,熊丽琴,李富友. 上转换发光成像技术与靶向成像应用[J]. 生物物理学报,2010,26(8):702-710.) 由图(a,b,g,h)可知，相比于荧光成像的成像结果，上转换荧光成像的成像结果中，几乎观察不到肠道等器官的背景荧光，而且光的吸收散射等现象也有所减弱，光的穿透更高，整体的成像效果更好。图(a)(b)为上转换材料成像结果；图(g)(h)为量子点 QD625 成像结果。在不同激发光，相同发射光的条件下进行成像，上转换荧光成像的信噪比更高 优点：较深的光穿透深度无生物背景荧光干扰对生物组织几乎无损

生物发光（bioluminescence）是指生物体发光或生物体提取物在实验室中发光的现象。生物发光成像是一种研究技术，它使用来自自然物种的荧光素酶或这些酶的改良荧光素酶来跟踪细胞或动物内部的生物过程。荧光素酶通常编码在报告基因中，该报告基因被引入到感兴趣的细胞或动物中。感光相机(CCD)检测到的光子数代表了所选生物过程的变化。 实验原理：利用转基因技术，将荧光素酶基因连接于启动子下游，稳定整合到质粒内，再通过原核显微注射的方法，使其整合到小鼠受精卵基因组中下，并稳定遗传给后代。使荧光素酶在生物体内得到持续表达，注射底物后与表达的荧光素酶反应发光。（自发光，其信号的发射不需要外部光源激发）。目前，比较常用的是萤火虫荧光素酶和海肾荧光素酶。优势：低背景，避免了小鼠自发荧光的干扰和减少了外界激发光源的干扰高灵敏度，皮下少量的发光标记肿瘤细胞也可被检测到。如，AniView 100 在实际应用中，可检测到皮下至少 100 个发光标记的肿瘤细胞，但检测到的最少细胞数量与单个细胞的发光强度有关。不足之处：标记手段单一，只能通过转基因形式标记细胞、基因标记物单一，目前主要是使用萤火虫荧光素酶基因信

动物活体光学成像（Optical in vivo Imaging），指利用光学的探测手段结合光学探测分子对实验动物进行成像，来获得动物体内生物学信息的方法。根据探测方式的不同，光学成像可分为生物发光成像、荧光成像、上转换荧光成像、切伦科夫成像和 X-ray 成像等。其中，最常用到的是生物发光成像和荧光成像。生物发光是用荧光素酶（Luciferase）基因标记细胞或 DNA，而荧光技术则采用荧光报告基团（GFP、RFP、Cyt 及 dyes 等）进行标记。动物活体光学成像通过将目的基因、细胞、药物分子等做上标记后注射到动物体内。标记物多种多样，例如：萤火虫荧光素酶基因、荧光蛋白、荧光染料、量子点及其他纳米荧光颗粒等。体内光源发出的光，经过散射吸收后到达表面形成光斑。透过灵敏的光学元件（如 CCD），可将光信号转换成为电信号，再转换成图像输出。动物活体光学成像原理示意图 与传统实验相比，动物活体光学成像能够反映细胞或基因表达的空间和时间分布，从而了解活体动物体内的相关生物学过程、特异性基因功能和相互作用，对动物体内靶点、信号通路、代谢过程及动物活体内证实生物过程模型起到更好的探索作用；其次

稳定细胞株构建的第一个步骤就是细胞转染，这项实验的原理大家都清楚，但是为什么一上手就会出现多种问题，在实验第一步就栽了跟头呢？是细胞转染方法不对头？还是实验过程中的某个因素影响了转染效率？了解本文这11个注意事项，让你的细胞转染实验顺利通关！所谓转染，是指在真核细胞里导入具有生物功能的核酸并核酸的生物功能。通常选用的转染方法包括物理介导法（如电穿孔法、显微注射和基因枪等）、化学介导法（如磷酸钙共沉淀法、脂质体转染 ...