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作为一名急需科研成果的临床医生，或许你已经看见身边的同事发表过「Protocol」文章，也或许你从未听说过「Protocol」。但不可否认的是，越来越多同行已经开始学着发表一篇「Protocol」文章了。今天就让丁香科研君为你介绍一下这个在国内目前还比较小众的发文方法吧。什么是「Protocol」文章？「Protocol」是描述研究方法的一类文章，是在没有完成实验时就将试验方法发表的文章。简单来说，就是在真正开展临床试验前，先将整个临床试验的研究设计写成一份「说明书」。因此对于临床医生来说，它最大的魅力在于，发一篇「Protocol」文章并不需要你真正去进行一项临床研究，并拿到结局指标，因此不管是对于经费还是时间上的要求，都比较宽容，是一类比较好上手的文章。「Protocol」文章的发表现状如何？我们跟踪一下近 10 年 Web of Science 数据库中发表的「Protocol」文章，可以得出以下几个重要结论：「Protocol 」主要以 「Research Article」的形式被发表，因此完全不用担心单位不认可，这类文章用于晋升和毕业是没有任何问题的。「Protocol」论文

肿瘤浸润淋巴细胞（tumor-infiltrating lymphocyte, TIL）以其极强的识别肿瘤的特性已被证明在多种癌症临床治疗中具有巨大潜力。TIL 疗法与 CAR-T 和 TCR 细胞疗法的区别在于，T 细胞不需要经过基因工程的改造，且不同于 CAR-T 和 TCR 疗法只能靶向一个抗原，由于 TIL 细胞疗法是从肿瘤组织中直接分离淋巴细胞，由靶向癌细胞中多种抗原的淋巴细胞组成，因此可以通过多个靶点激发对癌细胞的细胞毒性反应。目前针对 TIL 研究正在如火如荼的进行，然而，一个难题却摆在科研工作者面前，由于 TIL 亚群的细胞数量可能非常低，很容易在分离时丢失 。所以，如何高效分离 TIL 细胞及其亚群是进行该细胞研究和临床治疗的重要一环。目前，市面上有不同的分离 TIL 细胞的方法，但由于并未针对初始肿瘤材料进行优化，因此只能提供低纯度和低活力的目标 TIL 细胞。此外，这些方法并不能从同一样品中分选出不同的细胞亚群，因此需要更多珍贵的肿瘤材料和进行更多轮的细胞分离及分选过程。德国美天旎生物技术基于其在细胞生物学领域强大而完备的技术平台，提供了一个自动化的完整 TIL

血液制品由于包含大量红细胞，给白细胞亚群的分离带来了不小的障碍。常见的实验方法均需要从血液样品中分离 PBMC （外周血单个核细胞）后，进一步获取目的白细胞类群。不仅时间成本巨大，且效率、纯度、得率及细胞活力等核心指标，均对下游研究带来不同影响。下图概述了 PBMC 中各种白细胞的比例。美天旎StraightFrom®全血磁珠系列基于细胞磁性分选金标准的 MACS 技术， 具备常规 MACS 分选磁珠所有优势的同时，更支持以全血及各种血液制品作为初始样品，快速精准高效分离目的细胞，为临床样本研究提供支持。针对不同血液样品内的组分及浓度不同提供多种StraightFrom 磁珠，可实现无需密度梯度离心，从血液样品直接高效分选高纯度、高活力的目的细胞亚群，如常见的 CD4+、CD8+、CD14+、CD19+ 及 CD56+等。用于研究的起始血液样品有哪些类型？以下是常用于分离研究白细胞亚群的初始血液样品及其特性：1. 全血全血献血所得样本是一种方便可得且细胞数量恒定，体积灵活可控的血液起始样品。全血作为血液来源的优点是样本新鲜，这对研究中性粒细胞等敏感细胞至关重要。抗凝剂通常用于血液样本中

红入桃花嫩，青归柳叶新。美好的春天已经来临。本周学术君继续带来 CNS 最新进展，助力大家勇攀科研高峰！1.Nature：乳酸直接调节蛋白质功能目前，尚不清楚乳酸积累是否会影响增殖状态。2023 年 3 月 15 日，哈佛医学院Edward T. Chouchani团队在Nature杂志发表研究论文Lactate regulates cell cycle by remodeling the anaphase promoting complex。该研究阐明了细胞周期调节机制，确定积累的乳酸盐通过在 SENP1 活性位点与锌形成复合物结合并抑制 SENP1，乳酸的积累传达了营养物质充满生长阶段的结果，以刺激复合物（APC/C）的适时开放、细胞分裂和增殖。图 1：来源Nature2.Cell Metabolism：女性抑郁症患病率更高的原因雌二醇水平下降可导致女性抑郁症，其原因不明。2023 年 3 月 17 日，武汉大学李艳、王高华及刘忠纯等团队联合在Cell Metabolism杂志发表研究论文Gut-microbiome-expressed 3β-hydroxysteroid dehy

我们对人胚的早期发育还知之甚少，知识来源主要是小鼠胚胎或体外培养人胚，小鼠胚胎无疑会忽略人鼠差异，体外培养则不能超过两周，导致 2～4 周是人胚研究的黑盒子期。而 4 周正是人胚器官发生的初期，此时胚胎刚结束原肠运动，很多器官开始从胚层中脱离形成初始结构，也就是各个成体器官最早的特异的祖先状态。同时，很多出生缺陷也发生在器官发生时期。另外，这时也是门特征阶段（phylotypic stage），即脊索动物门中各物种胚胎在这个时期高度保守。所以器官发生时期对于人胚研究非常关键。2023 年 3 月 16 日，中国海洋大学施威扬课题组与美国纪念斯隆凯特琳癌症研究所鲍志戎课题组合作在Nature Cell Biology上发表了文章A single-cell transcriptome atlas profiles early organogenesis in human embryos，构建了人类胚胎在器官发育初期（4～6 周）的单细胞转录组图谱，深度刻画了各个器官最初的特异的祖先状态，并发现未知细胞类型和人特异的空间模式，以及脊椎动物中保守的阶段调控机制。首先，作者收集了 8 个捐赠的胚

衰老是影响新冠疫苗效果的一个关键风险因素。虽然疫苗效力的下降可以广泛地归因于免疫衰老的影响，但导致老年人疫苗应答不足的分子机制仍然知之甚少。中国于 2021 年 7 月开始对 60 岁以上的老年人进行全面疫苗接种。据报道，灭活病毒疫苗在 18-59 岁的人群中具有足够的免疫防护，同时观察到，在老年人中可以诱导中和抗体的产生。然而，尚未有系统地评估老年人对新冠灭活病毒疫苗的综合免疫反应，特别是 T 细胞反应。因此，迫切需要解析老年人对疫苗免疫反应，尤其是特异性 T 细胞和中和抗体免疫应答不足的机制。2023 年 3 月 14 日，由暨南大学陈国兵教授、罗钧洪教授，梁晓峰教授，王鹏程副教授领衔、多单位科研团队合作于Nature Aging期刊发表了题为：Insufficient epitope-specific T cell clones are responsible for impaired cellular immunity to inactivated SARS-CoV-2 vaccine in older adults的研究论文。该工作以年轻和老年灭活疫苗接种队列的外周免疫细胞为

据统计，全世界有近 3800 万人感染了艾滋病病毒（HIV-1）。不幸的是，在普遍认知和治疗经验里，HIV-1 感染是不可治愈的，抗病毒治疗虽然有效，但必须终身服用，给人们带来了巨大的精神和经济负担。如何彻底治愈艾滋病，一直吸引着科研人员和医学专家们孜孜不倦地探索。2022 年 2 月 15 日，逆转录病毒和机会性感染会议（CROI）上，加州大学洛杉矶分校和约翰·霍普金斯大学的研究团队曾报告一个艾滋病治疗案例——纽约病人，这是全球首例可能被治愈 HIV 的有色人种女性。今日，这篇研究正式刊发在Cell杂志，题为HIV-1 remission and possible cure in a woman after haplo-cord blood transplant。该研究首次使用 CCR5Δ32/Δ32 单倍体脐血干细胞移植 (haplo-cord transplant) 法，治疗急性髓系白血病和艾滋病的混血妇女，证明这种移植能够增强患者对艾滋病毒毒株的耐药性，达到 100% 免疫重建和对艾滋病毒毒株的抗性，即使后期停止服用抗逆转录病毒药物，也没有检测到具有复制能力的病毒[1]。图 1

在哺乳动物中，新生命开始于精子与卵细胞成功相遇，形成受精卵，然后子代携带来自双亲的部分遗传物质。长久以来，这都是自然界中哺乳动物繁衍后代的定律，也是维持种群的重要方式。在鱼类和爬行动物中，还存在一种普遍的繁殖方式，称为孤雌生殖，仅由从未受精的卵母细胞产生后代，但这在哺乳动物的自然繁殖中并未发现。孤雄生殖这一方式更是罕见，仅在一种稀有杂交鱼类和一些无脊椎动物中有发现。2023 年 3 月 8 日，在弗朗西斯·克里克研究所举行的第三届国际人类基因组编辑峰会上，来自日本九州大学的Katsuhiko Hayashi介绍了他们的最新研究：通过将雄性小鼠细胞转化为卵子，他们最终创造了具有两个亲生父亲的小鼠后代。Katsuhiko Hayashi（图片来源：网络）2023 年 3 月 15 日，这项研究正式发表在 Nature 杂志，论文题为Generation of functional oocytes from male mice in vitro。研究人员将携带男性 XY 染色体的皮肤细胞重新编程为干细胞样状态，即所谓的诱导多能干细胞（iPSCs）。然后删除这些细胞中的 Y 染色体，并替换为从

近年来科学家们对代谢组学的关注度越来越高，有大量的代谢组学 SCI 得以发表，它成为继基因组学、转录组学和蛋白质组学之后的又一个热点研究领域。2019-2022 年代谢组学 SCI 发表数量在 PubMed 中检索“Metabolomics OR Metabolome”，2020-2022 年共发表 31,871 篇相关论文，今年截止目前的发文量为 10936 篇。更震惊的是，今年还没结束，就已经有 2023 年的 110 篇文章上线了！！！可见它在当下科研界的火热程度。代谢组学研究已逐渐成为目前关注颇高的组学方向：其一，大家普遍认可代谢物是反映生物表型、状态的最有效分子；其二，代谢物被认为是功能分子、信号分子，其慢慢与功能组相挂钩；其三，肠道微生物等新兴研究热点的带动。最直观的感觉，从上述代谢组学发表的期刊就能看出近几年代谢组学的项目数量的明显增速。但是，连连频发的代谢组学，如果对具体做什么和怎么做缺乏明确认知，无目的的流程化分析很难找到重要的结果。如何实现思路进阶，勇攀高分？本文小鹿将从 3 个层次文章解析代谢组学发文思路，供大家参考。常规思路：影响因子≤5分的文章研究思路这一梯度

质谱成像（Mass Spectrometry Imaging, MSI）作为一种新型的分子影像技术，能够直接从生物组织中获得大量已知或未知的内源性代谢物和外源性药物等分子的结构、含量和空间分布信息。相对于其他成像方法（如荧光成像、放射性标记成像等），该技术无需化学或放射性标记、不需复杂样品前处理，具有高特异性、高通量和空间信息保留的突出优势。质谱成像技术可以实现生物组织中上千代谢物的定性、定量和定位分析，结合生物信息学分析，发展为空间代谢组学方法，可从生物组织原位发现差异代谢物，并识别其生物学功能。空间代谢组学鹿明空间代谢组是基于质谱成像技术发展而来的，免标记、无需基质、周期短。通过质谱成像技术对不同组织器官中的代谢物进行定性、定量、定位三个维度的分析，突破传统代谢组研究损失空间信息的瓶颈。空间代谢组学作为一种新型的分子影像技术，能够直接从生物组织中获得大量已知或未知的内源性代谢物和外源性药物等分子的结构、含量和空间分布信息。图 1 |不同质荷比大小的代谢物在大鼠脑中的空间成像技术原理鹿明空间代谢组在解吸电喷雾电离质谱成像（DESI-MSI）技术上进一步升级，形成了空气动力辅助离子化解

代谢组学的研究目标是尽可能对生物系统中所有代谢物进行定性和定量的分析，是研究代谢物谱、代谢表型、代谢变化、代谢途径和发现生物标志物强大的分析工具。色谱-质谱联用技术整合了色谱的高效分离能力和质谱的强大分析功能，具有灵敏度高、选择性好、动态范围宽、信息丰富等优点，已成为代谢组学研究最常用的分析技术，能够在单次分析中获得数千种代谢物的信息，在血液、尿样和细胞等生物样品的代谢组学分析中占据重要地位。然而，对于结构复杂和异质性高的生物组织或器官中的代谢物分析，色谱质谱联用分析方法具有局限性，原因是其分析过程中所需的组织匀浆、代谢物提取、纯化和富集等前处理过程丢失了代谢物在组织中的空间分布信息。质谱成像（Mass Spectrometry Imaging, MSI）作为一种新型的分子影像技术，能够直接从生物组织中获得大量已知或未知的内源性代谢物和外源性药物等分子的结构、含量和空间分布信息。相对于其他成像方法（如荧光成像、放射性标记成像等），该技术无需化学或放射性标记、不需复杂样品前处理，具有高特异性、高通量和空间信息保留的突出优势。质谱成像技术可以实现生物组织中上千代谢物的定性、定量和定位分析，

空间代谢组学(Spatial Metabolomics)结合了质谱成像(Mass Spectrometry Imaging, MSI)和代谢组学，利用离子源直接扫描生物样品成像，不仅可以鉴定上百种甚至上千种代谢物的结构和相对含量，还可以在同一张组织切片上同时分析大量代谢物的空间分布特征，为传统代谢组学分析提供了全新的可视化视角，实现对代谢物进行定性、定量、定位三个维度的深入分析。相信您会关注，空间代谢组学研究切片是如何操作的？在样本准备过程中需要注意哪些事项？在脑、肝脏、肾脏、肿瘤、肺、心脏组织中重要检出物及检出大类占比是怎样的？首先我们必须要谈的是一般做空间代谢组学必须经历的几大步骤中，其中成败的关键一定离不开切片；线上的研究资料中很少详细对空间代谢组切片关注；本篇是鹿明生物经过多年的空间代谢组学研究经历，梳理的部分切片攻略。一、空代切片实验具体流程：样本核对；样本固定及安装；样本修片；确认切面；正式样本收集；切片检查核对；二、切片技巧及原因分析、解决方案鹿明生物空间代谢组学切片经验大放送，以下是我们整理的常见空间代谢组学中的切片问题：三、做空间代谢组学的热门组织检出大类占比的形式：

国家自然科学基金委员会通知通告随着国家自然科学基金委员会在 2021 年 9 月 30 日发布的《关于发布生命科学部 2021 年度指南引导类原创探索计划项目指南的通知》中，在附件:指南引导类原创探索计划项目“未来生物技术”项目指南中，对拟资助研究方向做了相关的通知，其中拟开展方向的相关研究中第 1 条：生命现象观测的高精度、多维度、跨尺度的新原理、新方法和新技术研究中提到关于空间多维组学的研究方向（如下图）图片来源于国家自然科学基金委员会推荐 2 篇运用空间多维组学中的一种空间代谢组学的研究策略；推荐的文章均来自中国医学科学院药物研究所天然药物活性物质与功能国家重点实验室再帕尔·阿不力孜教授、贺玖明教授团队。借此也感谢再帕尔·阿不力孜教授、贺玖明教授团队在空间代谢组学研究中做的大量工作和推出这么棒的技术。下面就一起来看看这 2 篇经典研究策略吧！12021 年 4 月，中国医学科学院药物研究所天然药物活性物质与功能国家重点实验室再帕尔·阿不力孜教授、贺玖明教授团队在分析化学一区《Analytical Chemistry》（IF：6.986）期刊发表封面文章，题为“Mapping me

1.空间代谢组对代谢物的定性原理？鹿明生物的空间代谢组采用空间成像仪器 AFADESI-MSI、Waters SYNAPT XS 对切片进行扫描和信息采集。获得切片上代谢物的 m/z，通过与数据库进行比对，获得代谢物的定性标注信息，并利用空间成像软件解析获得不同 m/z 的空间成像图。2.空间代谢组都有哪些空间分辨率？AFADESI-MSI 的空间分辨率（即一个像素点的尺寸大小）目前常用的有 100uundefined100um，40uundefined40um，20uundefined20um，鹿明生物 2023 年初正式引进 Waters SYNAPT XS 质谱成像系统，不断研发更高的空间分辨率。我们要根据自己关注的组织微区大小去选择合适的分辨率。比如对于脑组织、肾脏组织、心脏组织等样本经过切片后尺寸在 1cundefined1cm 左右，利用 100uundefined100um 分辨率就可以满足对关注的微区结构进行图像分析，此时我们不一定需要选择更高的分辨率进行检测。对于一些小体积样本，比如样本尺寸在 5mundefined5mm 以下，为了获得足够的像素点，形成更加清晰的成像图，并且关注的组织微区需要更高的分辨率才能获得足够的信息。3.能否介绍一下空间代谢

2023 年 2 月 5 日，同济大学附属同济医院张子强团队在 Gut Microbes（IF= 9.434）在线发表了肿瘤微生态调控的最新研究成果“Microbiome and spatially resolved metabolomics analysis reveal the anticancer role of gut Akkermansia muciniphila by crosstalk with intratumoral microbiota and reprogramming tumoral metabolism in mice”。该研究通过微生态组学及AFADESI 空间代谢组学等多个层面的研究，首次发现了肠道菌群和肺癌微生态之间潜在的全新调控作用，阐明了肠道/肿瘤菌群交互作用以及菌群参与调控肿瘤发生发展的关键机制。其中 AFADESI 空间代谢组学由鹿明生物提供技术支持；本研究的前提有如下几点：1.肠道菌群对肿瘤生物学有深远影响，比如口服双歧杆菌（Bifidobacterium）会增强 PD-L1 的治疗效果；2.肿瘤组织内部也有微生物存在，称为瘤内菌群。它可能会调

结直肠癌（CRC）的早期诊断是提高患者生存率的有效方式。目前临床常用的非侵入性和入侵式检测方法因其准确率低或对患者造成伤害，大规模使用仍受限制。因此，发展无创且准确的检测方法变得尤为重要。由国家癌症中心中国医学院科学院肿瘤医院崔巍研究员与专业多组学技术团队合作在医学一区消化道领域国际期刊《GUT》期刊发表了题为“Integrated analysis of the faecal metagenome and serum metabolome reveals the role of gut microbiome- associated metabolites in the detection of colorectal cancer and adenoma”的研究成果，通过非靶向代谢组、靶向代谢组以及 AFADESI-MSI 空间代谢组学研究方法，整合了宏基因组的数据，发现了可用于腺瘤及结直肠癌诊断的代谢标志物，建立的相关预测模型显示出较高诊断准确性，为结直肠癌早期诊断奠定坚实基础。其中 AFADESI-MSI 空间代谢组学由贺玖明教授团队提供技术支持。研究技术路线研究方法1、研究队列：

癌症治疗研究中的关键问题是可区分正常组织和肿瘤组织的靶向抗肿瘤药物开发在新药研发的早期，如何快速评估抗癌药物的肿瘤靶向性非常重要，且了解药物在肿瘤内的异质性分布更具挑战。开发一种高精度、高灵敏度的定量成像分析方法有望解决这一难题。开发一种高精度、高灵敏度的定量成像分析方法有望解决这一难题。质谱成像是一种无需标记的分子成像技术，它可提供有关生物体内药物和代谢物分布的时空信息，其在药物开发领域的应用正在迅速增加。中国医学科学院药物研究所天然药物活性物质与功能国家重点实验室贺玖明团队在《Theranostics》期刊发表的题为“Evaluation of the tumor-targeting efficiency and intratumor heterogeneity of anticancer drugs using quantitative mass spectrometry imaging”的研究成果，采用空气动力辅助解吸电喷雾离子化（AFADESI）技术和基于人工神经网络（ANN）的虚拟校正-定量质谱成像（VC-QMSI）方法，建立了针对紫杉醇及其衍生物前药的体内定量成像方法，为

肿瘤代谢的表征能够为癌症病理机制研究、肿瘤诊疗新指标和干预靶点的发现提供新的契机。然而，到目前为止，如何全面的发现肿瘤的异常代谢，尤其是如何从代谢物和代谢酶两个层面上原位地表征肿瘤的异常代谢仍然面临非常大的困难。中国医学科学院药物研究所天然药物活性物质与功能国家重点实验室再帕尔 · 阿不力孜科研团队在《PNAS》期刊发表的题为“Spatially resolved metabolomics to discover tumor-associated metabolic alterations”的研究论文，采用 AFADESI-MSI 技术，建立了空间分辨的原位代谢组学方法，并提出一种“下游代谢物与上游代谢酶关联” 的研究策略来表征肿瘤代谢改变；结合免疫组化分析验证，从代谢物和代谢酶两个层次和组织原位深入探究食管癌的代谢改变，发现并可视化表征了食管癌异常的代谢通路及其代谢酶。实验设计：收集 256 例人鳞片状食管癌（ESCC）组织标本，包括癌组织、癌旁组织和远端非癌组织，制成冰冻组织切片。如图 1 所示，采用空气动力辅助解吸电喷雾离子化质谱成像技术（AFADESI-MSI），采集上述组织中

先导篇21 世纪的最前沿科学之一，随着人类第一张基因序列草图的完成和发展，生命科学的研究也将进入一个崭新的后基因组学，在基因组-转录组-蛋白组-代谢组的系统生物学框架内（图 1），代谢组是生物动态调控系统中最接近于表型的阶段，是生命的本质特征和物质基础。代谢组学一方面由于与健康疾病、营养科学、药物毒性、环境科学等密切相关，未来广阔；另一方面，由于代谢物结构迥异、种类众多，在技术开发和应用方面也面临巨大挑战。图 1 | 组织/细胞的系统生物学框架，涵盖了基因组、转录组、蛋白组、代谢组，脂质组等【1】（图片来源：Wu RQ, J Dent Res. 2011）1.质谱技术质谱（ Mass SPectrometry）是带电原子、分子或分子碎片按质荷比（或质量）的大小顺序排列的图谱。质谱仪是一类能使物质粒子高化成离子并通过适当的电场、磁场将它们按空间位置、时间先后或者轨道稳定与否实现质荷比分离，并检测强度后进行物质分析的仪器。质谱仪主要由分析系统、电学系统和真空系统组成。1.1质谱分析的基本原理用于分析的样品分子（或原子）在离子源中离化成具有不同质量的单电行分子离子和碎片离子，这些单电荷离子在

1.质谱定义代谢组学就是研究生命体中所有代谢产物（小分子化合物）变化规律的科学，通过比较不同实验组之间代谢物的系统性差异来研究生命现象，并揭示其内在规律。在 DNA-RNA-蛋白质-代谢物这一中心法则框架内，代谢组学处于生命动态系统最下游，最接近于表型，它不仅是表型的描述性指标，还可以通过调节基因组、转录组、蛋白组等多组学来影响机体的生理功能。近年来，代谢组学发展迅猛，研究成果备受顶级期刊青睐。说到这里，您一定想了解代谢组学最早期的发展历史吧~~2.发展历史1970 年Baylor 药学院提出代谢轮廓分析1975 年Thompson 和 Markey 利用气质联用开展定量分析，同期 HPLC 及 NMR 对代谢物的分析也开始发展起来1986 年Journal of Chromatography A 初版一期代谢轮廓分析专辑，多类型样本的代谢轮廓分析发展迅速1997 年Oliver 提出来代谢组（metabolome）的概念1999 年Nicholson 等人提出 metabonomics 的概念2005 年Metabolomics 创刊3.代谢组学的应用与发展3.1代谢组学促进多学科，