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        PCR常见问题分析及解决方案

        互联网

        5201

        PCR技术的发明

        1983 Kary Mullis 发明

        1985 开始有文章发表

        1993 获诺贝尔奖

        广泛用于分子生物学研究领域

        变性--退火--延伸三个步骤

        1、模板DNA的变性:93℃-95℃左右

        2、模板DNA与引物的退火(复性):Ta=Tm-3~5 ℃

        3、引物的延伸:Taq DNA聚合酶之5’-3’DNA聚合酶活性

        PCR标准反应体系

        DNA模板
        p引物
        p反应缓冲液
        pMg 2+
        pdNTP
        p耐热聚合酶
        pddH2O

        反应体系对PCR扩增的影响

        1、DNA模板:

        纯度 蛋白、多糖、酚类等抑制PCR反应
        完整性 模板降解会导致PCR扩增无产物
        浓度 浓度适当

        2、引物

        设计 长度适当、避免二级结构和二聚体
        合成质量
        浓度 50uL体系引物加量为10-20 pmol

        3、反应Buffer

        pH、盐离子、稳定剂、增强剂
        提供缓冲环境

        4、Mg 2+浓度

        过高非特异性严重
        过低无扩增产物

        5、dNTP Mixture

        浓度适当,避免反复冻融

        6、ddH2O

        pH值适当,避免污染


        如何选择最合适的DNA聚合酶

        1、Taq酶——扩增效率最高发现
              1969年,美国黄石国家公园温泉

        活性

        5‘-3’ DNA聚合酶活性   强
              5‘-3’ DNA外切酶活性   弱  荧光探针(定量PCR方法)
              3‘-5’ DNA外切酶活性   无  错配率每个循环约1/6000
              3‘末端加“A”  能   产物可直接进行“TA”克隆

        生产质检

        诱导大肠杆菌表达、三次柱纯化,分离获得94kD重组蛋白。
              无核酸酶和细菌DNA污染
              能有效扩增人基因组单拷贝基因
              室温放置一周,无明显活性改变

        2.pfu酶——保真度高

        原理

        具3’-5’核酸外切酶活性,即校正功能。
              效率相对较低
              3‘末端不加“A”,加A后才可进行TA克隆。

        用途

        –表达基因的克隆
              –基因的定点突变
              –细胞内基因点突变分析(SNP)

        3.HotStart  Taq酶——特异性高

        原 理

        –蜡封
              –抗体抑制
              –化学修饰
              提高PCR特异性,减少甚至避免非特异性扩增
              3‘加“A”,可直接做“TA”克隆

        用 途

        –混杂模板
              –半定量、定量PCR

        4.混合酶——高扩增效率+高保真度

        Taq  plus

        Taq+pfu
              用于复杂模板(GC rich, 二级结构)扩增
              大多数情况下可替代Taq, 特别是产物在6Kb以上时,可扩10-20kb

        Long  Taq

        Taq+pfu
              超长片断扩增,15-40kb

        Taq  platinum

        HotStart+pfu
              高扩增效率+高保真度

        根据PCR实验的不同需求

        基因组扩增、RT-PCR  ———————  特 异 性
              基因突变、测序、 表达克隆————— 保 真 性
              构建基因图谱、测序等——  长片段扩增
              复杂模板扩增 (GC含量高、二级结构) —扩增效率


        PCR MasterMix

        PCR Master Mix 产品特点

        特 点

        • 快速简便   减少加样误差和污染
              • 灵敏度高   可扩增低至2个拷贝的目的模板
              • 特异性强   降低PCR反应的要求,增强特异性
              • 稳定性好   -20℃一年以上,反复冻融不影响活性

        适用范围

        •  大规模基因检测
              •  目的基因拷贝数极低的样本
              •  GC含量高,有二级结构的模板
              •  复杂基因组样本

        PCR常见问题分析

        PCR常见问题

        1、无扩增产物

        ①无扩增产物之模板原因
              ②无扩增产物之引物原因
              ③无扩增产物之PCR条件原因

        2、非特异性扩增或拖尾

        现象:条带与预计的大小不一致或者非特异性扩增带

        3、假阳性

        现象:空白对照出现目的扩增产物

        提高PCR特异性的策略

        四种策略

        1、巢式PCR(Nest-PCR)

        2、递减PCR(TouchDown PCR)

        –前几个循环使用严谨的退火条件提高特异性
              –循环设在比估算的Tm高大约5℃的退火温度下开始,然后每个循环降低1-2℃,直到退火温度低于Tm 5℃
              –特异性最高的目的模板会被优先扩增,这些产物在随后的循环中继续扩增占据优势
              –递减PCR对于那些不了解引物和目的模板同源性程度的方法更为有用,如AFLP、DNA指纹分析等

        3、热启动PCR(HotStart PCR)

        –热启动主要是通过抑制一种基本成分延迟DNA合成,直到PCR 仪达到变性温度
              –通常选择热启动Taq酶
              –热启动PCR是除了好的引物设计之外,提高PCR特异性最重要的方法之一

        4、使用PCR增强剂

        –甲酰胺,DMSO,甘油,甜菜碱等
              –可能的机理:降低熔解温度,有助于引物退火,辅助DNA聚合酶延伸通过二级结构区
              –增强剂浓度要适当

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