逆转录PCR(RT-PCR)扩增基因特异片段

逆转录PCR(RT-PCR)扩增基因特异片段

一、实验原理

RT-PCR是将RNA的反转录（RT）和cDNA的聚合酶链式扩增（PCR）相结合的技术。首先经反转录酶的作用从RNA合成 cDNA，再以cDNA为模板，扩增合成目的片段。RT-PCR技术灵敏而且用途广泛，可用于检测细胞中基因表达水平，细胞中RNA病毒的含量和直接克隆特定基因的cDNA序列。

作为模板的RNA可以是总RNA、mRNA或体外转录的RNA产物。无论使用何种RNA，关键是确保RNA中无RNA酶和基因组 DNA的污染。

二、实验试剂

Taq酶，M-MLV逆转录酶，dNTPs， DEPC处理水，双蒸水，大肠杆菌总RNA

三、实验 仪器

四、操作步骤

1．cDNA的合成：

逆转录体系的组成：

2．PCR扩增特异性片段

（1）25ul PCR体系的组成：

组分 体积

10×PCR Buffer 2.5μL dNTPs (2.5mM，each) 2μL Sense primer 1μL Antisense primer 1μL cDNA 1μL DEPC处理水 17 μL Taq 酶 0.5μL

五、实验注意事项

1. 整个操作始终注意避免RNA酶的污染；

2. PCR反应灵敏，注意避免 试剂 污染；

3. 酶易失活，整个操作注意在冰上进行。