逆转录-聚合酶链式反应（RT-PCR）
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实验试剂
3．dNTPmix：含dATP、dCTP、dGTP、dTTP各2mM
4．Taq DNA聚合酶实验步骤
（1）在0.5ml微量离心管中，加入总RNA 1-5μg，补充适量的DEPC H2O使总体积达11μl。在管中加10μM Oligo（dT）12-18 1μl，轻轻混匀、离心。
（2）70℃加热10min，立即将微量离心管插入冰浴中至少1min。
（3）加入SuperscriptⅡ1μl ，在42℃水浴中孵育50min。
（5）将管插入冰中，加入RNase H 1μl ，37℃孵育20min，降解残留的RNA。-20℃保存备用。
（2）加入适量的ddH2O，使总体积达50μl。轻轻混匀，离心。
（3）设定PCR程序。在适当的温度参数下扩增28-32个循环。为了保证实验结果的可靠与准确，可在PCR扩增目的基因时，加入一对内参（如G3PD）的特异性引物，同时扩增内参DNA，作为对照。
（5）密度扫描、结果分析：采用凝胶图像分析系统，对电泳条带进行密度扫描。注意事项
（1）、在实验过程中要防止RNA的降解，保持RNA的完整性。在总RNA的提取过程中，注意避免mRNA的断裂。
（4）、PCR不能进入平台期，出现平台效应与所扩增的目的基因的长度、序列、二级结构以及目标DNA起始的数量有关。故对于每一个目标序列出现平台效应的循环数，均应通过单独实验来确定。
（5）、防止DNA的污染：采用DNA酶处理RNA样品，在可能的情况下，将PCR引物置于基因的不同外显子，以消除基因和mRNA的共线性。
