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        细胞内钙测定

        互联网

        2522

        式中Kd为 Fura-2与Ca 结合反应的介离常数,37℃ 时其值为224nmol/L,Fmax是细胞内Fura-2全部为Ca 饱和时的荧光比值(采用Ca 载体),Fmin为Fura-2完全未结合Ca 时的荧光比值。通过向介质中加入过量的EGTA将细胞内外的游离Ca 螯合,此时测得的最小荧光值。F为实验中以340nm和380nm波长激发,500nm波长发射测定负载Fura-2/AM细胞的荧光比值。

         

         

        静息态时[Ca ]i<0.1umol/L。[Ca ]0 浓度为1~1.5mmol/L,细胞内外[Ca ]相差104 。细胞膜内外的[Ca ]差是细胞外的Ca 进入细胞内的推动力。

         

        ( 组织细胞以12.5%胰蛋白酶消化20-30 min)

         

        37 温育10min, 加入Fura-2/AM(终浓度为2-5ug/ml),37℃ 恒温震荡45 min,负载后细胞以含0.2%牛血清白蛋白的Hank’s液洗2次,用Hank’s液调细胞数为1×106 ,测定前37℃ 复温5-10 min。

         

        37℃ 温育10 min,测荧光(负载Fura-2/AM细胞的荧光比值F)

         

         

        Triton X 100 100 μl

         

         

        37℃ 温育5 min

         

         

        340nm测荧光(最大值Fmax)

         

         

        20℃ 水浴5 min

         

         

        冰浴 2 min

         

         

        EGTA 80μl(40mM )

         

         

        水浴5 min → 冰浴 5 min

         

         

        380 nm 测定荧光(最小值Fmin)

         

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