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        正常人骨膜内成骨细胞原代培养

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        实验材料:

        1. 骨组织来源:手术切除之骨组织;

        2. 清洗液:不含Ca2+ 和Mg2+ 的1×PBS,添加100IU/ml青霉素、100μg/ml链霉素,pH7.2;

        3. 消化液:0.25%胰蛋白酶溶液,1mg/mlⅠ型胶原酶溶液;

        4. 培养液:RPMI 1640培养基,配制培养液时加入15%的小牛血清,并用5.6% NaHCO3 调节至pH 7.2.

        实验方法:

        1. 取人手术切除之骨膜,放入盛有缓冲液的培养皿中,去除附于骨膜上的结缔组织;

        2. 将骨膜剪碎成1—2mm2大小的组织块(膜片);

        3. 加入0.1%EDTA与0.25%胰蛋白酶(1:1,V/V)混合消化液,在37℃下消化20—30min。以1000r/min离心1—2min,沉淀骨膜组织块,除去上清液;

        4. 用缓冲液洗沉淀骨膜组织块2—3次,重复上述离心过程;

        5. 在37℃下再用1mg/mlⅠ型胶原酶消化骨膜组织块约90min。离心(1000r/min,5—10min)以沉淀细胞,弃去消化液。再用培养液洗1—2次,离心收集细胞;

        6. 加培养液于离心管中分散细胞,调成细胞密度1×106 —5×106 个/ml的悬液。将细胞悬液种植于培养瓶中。也可不使用消化酶而行植块培养法种植培养,培养条件同前;

        7. 待细胞长满培养瓶壁后进行传代培养.

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