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        单克隆抗体的制备

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        一、实验目的:

        单克隆抗体制备是细胞免疫学的一个重要里程碑,它涵盖了细胞培养、细胞融合、免疫动物和抗体效价检测等各个方面内容。了解单克隆抗体制备的原理、主要步骤和方法。

        二、实验原理:

        骨髓瘤细胞在体外培养能大量无限增殖,但不能分泌特异性抗体;而抗原免疫的B淋巴细胞能产生特异性抗体,但在体外不能无限增殖。将免疫脾细胞与骨髓瘤细胞融合后形成的杂交瘤细胞,继承了两个亲代细胞的特性,既具有骨髓瘤细胞能无限制增殖的特性,又具有免疫B细胞合成和分泌特异性抗体的能力。

        经在HAT培养基[含有次黄嘌呤(H)、氨基喋呤(A)和胸腺嘧啶核苷(T)]中进行选择性培养,未融合的脾细胞因不能在体外长期存活而死亡;未融合的骨髓瘤细胞合成DNA的主要途径被培养基中的氨基蝶呤阻断,又因缺乏次黄嘌呤-鸟嘌呤-磷酸核糖转移酶(HGPRT),不能利用培养基中的次黄嘌呤完成DNA的合成过程而死亡。

        只有融合的杂交瘤细胞由于从脾细胞获得了次黄嘌呤-鸟嘌呤-磷酸核糖转移酶,因此能在HAT培养基中存活和增殖。经过克隆选择,可筛选出能产生特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞,在体内或体外培养,即可无限制地大量制备单克隆抗体。

        三、试剂与器材:

        细胞培养板、解剖器械、平皿、酶标仪、加样器、细胞计数板、CO2培养箱、倒置显微镜等。

        四、操作方法:

        1、抗原制备;

        2、免疫动物;

        3、免疫脾细胞和骨髓瘤细胞的制备;

        4、细胞融合;

        5、杂交瘤细胞的选择培养;

        6、杂交瘤细胞的筛选;

        7、杂交瘤细胞的克隆化;

        8、单克隆抗体的检定;

        9、分泌单克隆抗体杂交瘤细胞系的建立;

        10、单克隆抗体的大量制备。

        五、关键步骤与注意事项:

        1、整个制备过程需严格无菌

        2、细胞传代培养时注意适时更换培养液

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