Sanger测序法的基本原理

Sanger测序法的基本原理

 

DNA测序技术是现代分子生物学研究的基石，其中Sanger测序法作为dìyī代测序技术的代表，其基本原理建立在链终止法的巧妙设计上。该方法由Frederick Sanger于1977年开发，核心在于利用2',3'-双脱氧核苷三磷酸(ddNTP)作为链终止剂。在常规PCR反应体系中，除加入正常脱氧核苷三磷酸(dNTP)外，还按特定比例掺入四种ddNTP(分别标记不同荧光染料)，当DNA聚合酶在模板链指导下合成新生链时，ddNTP的掺入会导致延伸反应不可逆终止。通过jīngquè控制反应条件，可产生一系列长度仅相差一个碱基的DNA片段，这些片段经毛细管电泳分离后，通过检测末端ddNTP携带的荧光信号，即可确定DNA序列信息。

 

Sanger测序法的基本原理涉及三个关键生化过程：首先是模板DNA的变性处理，将双链DNA解离为单链；其次是引物退火，使测序引物与模板特定区域结合；zuì后是延伸-终止反应，DNA聚合酶从引物3'端开始延伸，随机掺入ddNTP导致链终止。这一过程在四个独立反应或单一混合反应中进行，取决于是否采用荧光标记。现代自动化测序仪通常采用四色荧光标记系统，将四种ddNTP(分别对应A、T、C、G)标记不同荧光基团，实现单管反应和高效检测。毛细管电泳的高分辨率可区分长度相差仅一个碱基的DNA片段，通过激光激发和CCD检测系统捕获荧光信号，zuì终转化为序列峰图。

 

该技术的测序读长通常可达800-1000bp，准确率高达99.99%，使其成为验证性测序的金标准。具体费用需要根据实验需求和样品情况来确定。Sanger测序法的基本原理决定了其特别适合小规模、高准确度的测序需求，如克隆验证、SNP检测和突变分析。与高通量测序技术相比，其优势在于长读长和高准确性，但通量较低。反应体系中dNTP与ddNTP的浓度比是关键参数，直接影响终止效率和序列质量。优化后的终止概率应保证各长度片段均匀产生，避免信号强度波动。热稳定DNA聚合酶的选择也至关重要，常用修饰后的Taq酶或重组酶以提高延伸效率和保真度。

 

在仪器检测环节，Sanger测序法的基本原理要求高精度的电泳分离系统。现代毛细管阵列电泳可同时分离96或384个样本，电场强度、凝胶基质和温度控制共同决定分离分辨率。荧光信号采集系统需要jīngquè校准，消除不同染料间的光谱重叠。基线校正和峰识别算法对原始数据的处理直接影响zuì终序列质量。为提高信噪比，通常采用纯化后的PCR产物作为模板，避免引物二聚体和非特异性扩增产物的干扰。对于复杂模板如富含GC区域，可添加DMSO或甜菜碱等增强剂改善二级结构问题。

 

常见问题：

 

Q1. 为什么Sanger测序法对模板纯度要求较高？

A：杂质如盐离子、dànbáizhì或有机溶剂会干扰DNA聚合酶活性，导致不wánquán延伸或非特异性终止。特别是EDTA等螯合剂会结合Mg²⁰，影响酶活性中心构象。建议使用硅胶膜纯化或磁珠法获取高纯度模板，OD260/280比值应控制在1.8-2.0之间。

 

Q2. 如何解释测序结果中出现的"双峰"现象？

A：双峰通常指示样本中存在序列杂合或混合模板。在SNP位点会出现两个信号峰，峰高比反映等位基因频率。若为克隆测序，可能源于载体连接时产生的嵌合克隆，建议重新挑取单菌落或进行TA克隆测序验证。系统误差如荧光染料脱落也可能导致次要峰，可通过反向测序排除。