蛋白质免疫检测技术服务

Western Blot 实验
      通过SDS-PAGE胶将不同的分子量的蛋白分离开，将目标蛋白转移到PVDF膜上，再利用抗原抗体的特异性结合，用特异性的一抗结合目标蛋白，用HRP标记的二抗结合一抗，再加以ECL发光液显色，检测目的蛋白在不同处理的样本中表达量的高低变化

服务优势及实验服务流程：

1、利用高性能试剂配合高通量全自动western blot机，提供超高灵敏性的western blot实验服务。超高灵敏度最低至15飞克抗原。
2、一抗的寄送需要泡沫盒加冰袋低温即送。
3、如果客户提供裂解的样品，样品的裂解液需包含蛋白酶抑制剂，并且加入上样缓冲液煮沸5分钟后，再用泡沫盒加冰袋寄送，如此可保证样品不产生降解。

4、如果客户提供未裂解的组织样品，需要用干冰加厚泡沫盒，超低温寄送。
5、结果：western blot机以全自动的方式模拟客户的手工western blot操作，并配置了800万超高像素的制冷CCD进行信号捕获，配套了灵敏度高于thermo最高品质发光液4倍的超敏ECL发光液进行信号释放，western blot机还配套了低背景封闭及抗体增敏稀释液，膜上抗体高效剥离液进行全自动运作。
6、 客户可通过电子邮件等方式获得结果照片及实验流程等全部实验数据、由我们专业的技术员进行灰度分析，并给出数据报告。
 

一、材料与方法：

1．试剂
 

Protein lysis buffer		P001
BCA Protein Assay Kit	cwbiotech	02912E
Protein ladder	Biomed
PVDF membrane，0.45um	Millipore
Acrylamide	Amresco	0341
Bis-Acrylamide	Amresco	0172
Glycine	Sigma	G8898
SDS	Sigma	L4390
APS	Amresco	0486
TEMED	Amresco	0761
Tween-20	Amresco	0777
Bromphenol Blue	Amresco	0449
DTT	Amresco	0281
Trizma base	Sigma	T1503
Protease inhibitor cocktail	Roche	04693116001
Non-fat milk	Erie	yili
ECL	Millipore	WBKLS0500
Methanol       (dried)	Sinopharm	10014118
nacl	Sinopharm	10019392
goat anti rabbit IgG（H+L），HRP	Jackson	111-035-003
goat anti mous IgG（H+L），HRP	Jackson	115-035-003

 

 2．仪器：

Highspeed refrigerated centrifuge	XIANGYI
MultiskanMirco-plate reader	Thermo
VE180 Mini-protean3 Dodeca	Tanon
VE186 TBC	Tanon
PowerPac HC Power Supply	BioRad
PH meter	Sartorius
shaker	Kylin-Bell
homogenizer	Fluka

 

3. 溶液配制：

1.0mol/LTris·HCl

Tris (MW121.14)	30.29g
蒸馏水	200ml
溶解后，用浓盐酸调 pH至所需点，最后用蒸馏水定容至 250ml，高温灭菌后室温下保存。
PH调节：    PH	HCl
6.8	约 18ml
8.0	约 6ml

1.74mg/ml(10mmol/L) PMSF

PMSF	0.174g
异丙醇	100ml
溶解后，分装于 1.5ml离心管中，-20℃保存。

 10％SDS

SDS                    10g

蒸馏水至               100ml

50℃水浴下溶解，室温保存。如在长期保存中出现沉淀，水浴溶化后，仍可使用。

 10％过硫酸胺（APS）

过硫酸胺             0.1g

超纯水               1.0ml

溶解后，4℃保存，保存时间为 1周。

 1.5mol/LTris·HCl（pH8.8）

Tris  (MW121.14)         45.43g

超纯水                   200ml

溶解后，用浓盐酸调 pH至 8.8，最后用超纯水定容至 250ml，室温下保存。

 0.5mol/LTris·HCl（pH6.8）

Tris  (MW121.14)         15.14g

超纯水                   200ml

溶解后，用浓盐酸调 pH至 6.8，最后用超纯水定容至 250ml，室温下保存。

 30％Acr/Bic

丙稀酰胺（Acr）	29g
甲叉双丙稀酰胺（Bic）	1g
超纯水	100ml
溶解后 4℃保存。使用时恢复至室温且无沉淀。

还原型5XSDS 上样缓冲液

0.5  mol/L Tris·HCl（pH6.8）	2.5ml
二硫叔糖醇（DTT，MW154.5）	0.39g
SDS	0.5g
溴酚蓝	0.025
甘油	2.5ml
混匀后，分装于 1.5ml离心管中，4℃保存。

电泳液缓冲液

Tris（MW121.14）	3.03g
甘氨酸（MW75.07）	18.77g
SDS	1g
蒸馏水至	1000ml
溶解后室温保存，次溶液可重复使用 3～5次。

 转移缓冲液

甘氨酸（MW75.07）	2.9g
Tris（MW121.14）	5.8g
SDS	0.37g
甲醇	200ml
蒸馏水至	1000ml
溶解后室温保存，次溶液可重复使用 3～5 次。

10X 丽春红染液

丽春红S	2g
三氯乙酸	30g
磺基水杨酸	30g
蒸馏水至	100ml
使用时将其稀释 10倍。

TBS 缓冲液、TBST 缓冲液

TBS 缓冲液         1mol/L Tris·HCl（pH7.5）                                    NaCl    蒸馏水至	10ml
8.8g
1000ml
（可以配制成 10×TBS缓冲液进行保存，稀释 10倍使用）
TBST 缓冲液        20％Tween20	1.65ml
TBS	700ml
混匀后即可使用，最好现用现配。

封闭液

脱脂奶粉/BSA	5g/3g
TBST	100ml

 4. SDS-PAGE胶配制：

 三、实验方法:

1. 蛋白抽提

    预冷RIPA蛋白抽提试剂，加入蛋白酶抑制剂Protease inhibitor cocktail （Roche）（磷酸化蛋白需要同时加入磷酸酶抑制剂）。将组织按照10%匀浆（例如10mg加入100ulRIPA裂解液），进行匀浆。冰上孵育20min后，13000rpm（4度）离心20min。取上清，分装-80度保存，待测。

2. BCA法蛋白定量

按照BCA蛋白定量试剂盒使用说明操作，测定蛋白浓度。

1、根据样品数量，试剂A：B=50:1配制适量BCA工作液，充分混匀。BCA工作液室温24小时内稳定。

2、完全溶解蛋白标准品，取10μl稀释至100μl，使终浓度为0.5mg/ml。

3、将标准品按0, 1, 2, 4, 8, 12, 16, 20μl加至96孔板的标准品孔中，并用标准品稀释液补足20μl。

4、将待测样品滴加至样品孔中，用标准品稀释液补足20μl。

5、各孔加入200μl BCA工作液，37℃放置30min。

6、测定A570 nm，绘制标准曲线图并计算蛋白浓度（蛋白浓度结果见excel表格）。

3、 蛋白浓度调整

4 、 WB实验

（1）  根据目的蛋白的分子量，配制12%胶，浓缩胶浓度为5%。

（2）  待检测蛋白样品上样量: 40ug/孔

（3）  电泳条件：浓缩胶恒压90V，约20min；分离胶恒压150V，通过预染蛋白marker来确定电泳停止时间。

（4）  湿转法，转膜条件：300mA恒流；0.45um孔径PVDF膜，转膜时间1h。转膜完成后丽春红染色试剂对膜进行染色，观察转膜效果。

（5）  封闭：将膜完全浸没于5%BSA-TBST中，水平摇床孵育2h（RT）。

（6）  一抗孵育：5%BSA-TBST稀释一抗， 4℃水平摇床孵育过夜。

（7）  次日，洗膜：TBST洗3次，每次10min。

（8）  二抗孵育：5%BSA-TBST稀释二抗：山羊抗兔,山羊抗鼠IgG（H+L）HRP 1:10000，室温孵育 40min。洗膜：TBST洗膜3次，每次10min。

（9）  ECL滴加到膜的蛋白面，反应3min；胶片曝光：10s-5min（曝光时间随不同光强度而调整），显影2min，定影。

四、实验结果

 1：检测条带见JPG和PPT文件。

 2：数据分析(图片扫描后，并使用软件为:Gel Image ststem ver.4.00(tanon,china)

对图像进行灰度分析

 3：出具实验报告

实验全程客观准确、结果真实，最大限度减少人为误差干扰，还原实验本真