杂交

用标记的 M13 mp9 DNA 与 Southern 印迹后的细胞 DNA 杂交，严格冲洗后，通过放射自显影技术，观察与 M13 序列结合的 DNA 片段分布图谱 [ Westneat et al.，1988 ] 。

1. 在聚乙烯三明治盒中，把膜（最多三张膜）放入 200 ml 55°C 预热预杂交液（0.263 mol/L 磷酸氢二钠；7 % （W / V）SDS，1 mmol/L EDTA，1 % （W / V）BSA 片段 V （Roche））中。

2. 55°C下，摇动盒子 4 h。

3. 把膜转移到第二个三明治盒子 150 ml 55°C 预热预杂交液中，同时加人煮沸并冷却的探针。

4. 摇动盒子 55°C 下过夜，至少 16 h。

5. 将两张膜转移到 1 L 的严谨冲洗液中，室温下摇动该混合物 15 min。

6. 重复步骤 5。

7. 用 1 L 55°C 预温的严谨冲洗液替换前液，加人 0.1% SDS，55°C 下摇动 15 min。

8. 室温下用 1× SSC （20× SSC 储存液：175.3 g NaCl （Analar Merck）和 88.2 g 柠檬酸钠（ Analar Merck）溶解于蒸馏水中，最终体积为 1 L，pH7. 2）冲洗膜。

9. 将膜置于滤纸上，在空气中干燥至微潮状态，然后用保鲜膜包裹住，并用盖格计数器监测表面放射性，-80°C 放射自显影确定 X 射线曝光的时间，在放射自显影胶片盒中每张杂交后的 Southern 膜可放两张胶片（如富士 RX）。

10. 为较准确地估计所需的最终曝光时间，第一张胶片要曝光过夜，使用标准的 X 射线片显影试剂。[ 例如，1：5 （V / V）的 CD15 显影 5 min，CD40 定影 5 min ]

涉及放射性物质的操作，应该按照国家和当地条例进行操作，开展这样的工作之前要向当地生物安全部门咨询。