类器官培养与应用——结直肠类器官

结直肠癌（Colorectal Cancer, CRC）是全世界最常见的癌症之一。在过去的十年中，预防性筛查项目的推广使死亡率大幅下降，然而在许多国家范围内，结直肠癌仍然是癌症相关死亡的第二大原因^【1】。

几十年来，癌细胞系和基因编辑小鼠^【2】一直是 CRC 研究的主要模型，人类肿瘤患者衍生异种移植(PDX)也已成为了 CRC 研究的工具^【3】。与此同时，能够在体外进行长期培养的原发性/转移性 CRC 类器官模型进一步扩大了研究人员的选择范围。类器官既可以像 PDX 一样代表了个体患者的真实肿瘤情况，又兼具了细胞系的可传代、易于高通量筛选等特性。因此，CRC 类器官模型正在广泛应用于药物研究、个性化医疗等领域。

本篇文章基于 Nature Chemical Biology^【4】、STAR protocols^【5】、Nature protocols^【6】和 Cell^【7】发表的四篇文章，整理了人类结直肠癌组织来源的类器官培养方案。

图 1. 病人组织来源的 CRC 类器官研究方案^【8】

细胞来源

活检样本或手术样本

 

培养基配方

	解离培养基	类器官培养基	红细胞裂解液	细胞冻存液	近岸蛋白产品货号
基础培养基	DMEM/F12	DMEM/F12	-	60%类器官培养基
Penicillin-Streptomycin	-	1%	-	-
FBS	-	-	-	-
KnockOut Serum Replacement	-	-	-	30%
Collagenase IV	1mg/ml	-	-	-
RNase-Free DNase	30 Kunitz Units	-	-	-
GlutaMAX	-	2mM	-	-
Non-Essential Amino Acids	-	1×	-	-
HEPES	-	10mM	-	-
N2	-	1×	-	-
B27	-	1×	-	-
Heparin	-	4μg/ml	-	-
EGF	-	20ng/ml	-	-	C029
FGF basic	-	10ng/ml	-	-	C046/C779
Noggin	-	100ng/ml	-	-	CB89
R-spondin 1	-	500ng/ml	-	-	CX83
Y27632	-	10μM	-	-
SB202190	-	3μM	-	-
A83-01	-	500nM	-	-
N-acetyl-L-cysteine	-	1μM	-	-
Nicotinamide	-	10mM	-	-
Gastrin I	-	10nM	-	-
氯化铵	-	-	0.8%	-
EDTA	-	-	0.1mM	-
DMSO	-	-	-	10%

 

组织处理

1、将新鲜 CRC 组织样本放入预冷的 PBS 中，剔除脂肪组织和坏死的肿瘤组织（通常为黄色或白色），只选取活的肿瘤组织（通常为粉红色）。

2、将 CRC 组织转移到含有 5 mL 预冷的 PBS 溶液中清洗，去除血液和碎片。为防止污染，需要多次重复此步骤至液体变澄清。

3、吸出 PBS，将组织切割为 1-2 mm³ 的小块，此步骤可以留存适量组织用于测序、免疫组化分析等。

4、将剩余组织块切碎，并加入 1 ml 预冷的类器官培养基，用 p1000 吸头将肿瘤碎片悬浮液转移到含有 5 ml 解离培养基的离心管中，轻轻震荡混匀后，放置于 37℃ 培养箱中解离 1 h。每隔15min 轻轻震荡或吹打混匀一次。

5、加入 8ml 预冷的 DMEM/F12（含 10%FBS）终止消化。

6、将悬浮液经过 70μm 细胞筛网过滤，收集解离的细胞。

7、将过滤的细胞悬液在 4℃ 条件下 450g 离心 5min。

8、若细胞沉淀有明显的红色，则将细胞重悬于 5ml 的红细胞裂解液中，冰上孵育 10min 使红细胞裂解。

9、向细胞悬液中加入 5ml DMEM/F12 冲洗细胞一次，离心收集细胞沉淀后，加入 1-2ml DMEM/F12 重悬细胞，并进行台盼蓝染色和细胞计数。

 

类器官培养

10、将冻存的 Matrigel 在 4℃ 下过夜解冻，在冰上以 3：1 的体积比将 Matrigel 与细胞悬液混合，轻轻吹打混匀避免产生气泡。

11、从 37℃ 培养箱中取出预热的 24 孔板，将 80μl 混合液接种在各孔中，注意需接种在孔的中心，避免接触侧壁。

12、将 24 孔板室温放置 5min 后，转移至 37℃，5%CO₂ 的培养箱中孵育 10min，使 Matrigel 固化。

13、向每个孔中缓慢滴加 650μl 预热的类器官培养基，确保基质胶被完全覆盖。放于 37℃，5%CO₂ 的培养箱中培养，每 2-3 天更换培养基（用于换液的类器官培养基内不含 Y27632)。

 

类器官传代

14、吸出类器官培养液，机械分离 Matrigel，然后加入 500μl 胰蛋白酶，放置于 37℃ 培养箱中孵育 1-2min 后，用移液器多次吹打，从基质胶中释放类器官。

15、用含有 10%FBS 的 DMEM/F12 培养基终止消化，在 4℃ 条件下 300g 离心 5min。

16、用冷 PBS 清洗后，再次 4℃ 条件下 300g 离心 5min。

17、将所得沉淀按照 1:3-1:5 的比例重复 10-13 步骤（具体比例通过类器官的汇合度确定），完成传代。

 

类器官冻存

18、取 1-2 个孔的类器官，消化离心后取细胞沉淀，加入 1ml 细胞冻存液。

19、将细胞重悬后转移至冻存管中，利用程序降温盒缓慢降温至 -80℃。

20、第二天，将样品转移到液氮中长期储存。

 

类器官复苏

21、将液氮冻存的 CRC 类器官放置在 37℃ 水浴锅中进行解冻，水浴时间不宜超过 2min。

22、将细胞悬液转移至 15ml 离心管中，加入 10ml 预冷的 DMEM/F12 培养基（含10% FBS）。4℃ 条件下 300g 离心 5min，取细胞沉淀。

23、将所得沉淀重复 10-13 步骤，完成 CRC 类器官复苏。

图 2. 显微镜下 CRC 类器官的形态，以及 Ki-67、E-Cadherin 标记物的表达^【5】

利用类器官技术，能够将 CRC 和正常结直肠组织在体外进行长期扩增，并且在微卫星稳定（MSS）来源的 CRC 类器官中发现，类器官模型能够保留样本的遗传多样性和形态稳定性^【9】。结直肠（癌）类器官的进一步优势包括可以进行建库、细胞异质性研究、实验动物移植、个体患者分析和基因编辑，目前已经成为了疾病建模的优秀工具，未来可能在再生医学领域大放异彩^【10】。

图 3.结直肠（癌）类器官在基础和临床研究中的应用^【10】

 

 

参考文献

【1】TORRE, Lindsey A., et al. Global cancer statistics, 2012. CA: a cancer journal for clinicians, 2015, 65.2: 87-108.

【2】EVANS, Jonathan P., et al. From mice to men: Murine models of colorectal cancer for use in translational research. Critical reviews in oncology/hematology, 2016, 98: 94-105.

【3】BROWN, Kai M., et al. Patient-derived xenograft models of colorectal cancer in pre-clinical research: a systematic review. Oncotarget, 2016, 7.40: 66212.

【4】TOSHIMITSU, Kohta, et al. Organoid screening reveals epigenetic vulnerabilities in human colorectal cancer. Nature Chemical Biology, 2022, 18.6: 605-614.

【5】BERGIN, Christopher J., et al. Protocol for serial organoid formation assay using primary colorectal cancer tissues to evaluate cancer stem cell activity. STAR protocols, 2022, 3.1: 101218.

【6】FUMAGALLI, Arianna, et al. A surgical orthotopic organoid transplantation approach in mice to visualize and study colorectal cancer progression. Nature protocols, 2018, 13.2: 235-247.

【7】VAN DE WETERING, Marc, et al. Prospective derivation of a living organoid biobank of colorectal cancer patients. Cell, 2015, 161.4: 933-945.

【8】SASAKI, Nobuo, et al. Studying cellular heterogeneity and drug sensitivity in colorectal cancer using organoid technology. Current Opinion in Genetics & Development, 2018, 52: 117-122.

【9】BEHJATI, Sam, et al. Genome sequencing of normal cells reveals developmental lineages and mutational processes. Nature, 2014, 513.7518: 422-425.

【10】BARBÁCHANO, Antonio, et al. Organoids and colorectal cancer. Cancers, 2021, 13.11: 2657.