经验分享｜动物活体光学成像实验——荧光成像（一）【自发荧光】
博鹭腾生物
动物活体荧光成像实验中，一般利用荧光蛋白选择性地标记目标细胞，或用荧光染料标记药物，再通过活体成像系统进行详细观察。但是在荧光成像过程中，当观察目标的荧光信号微弱时，自身荧光会干扰目标荧光的识别。自发荧光是指由细胞结构或代谢产物等产生的自然荧光。从小分子（糖、脂肪酸、氨基酸、核苷酸、离子和水等）和大分子（蛋白质、磷脂、RNA、DNA 和多糖等）到更大的结构（如细胞器和细胞膜），覆盖了大部分可见光谱范围（400-700 nm）。自发荧光与标记物发射波长重叠的时候，经激发光照射会发射出与标记物相似的荧光波长，导致低信噪比，检测灵敏度受限，在某些情况下甚至根本无法检测或显示标记物荧光。
例如，比较常用的标记物 GFP，其最佳激发波长为 470 nm，最佳发射波长为 509 nm。在被 470 nm 激发光激发，会发射出波长 509 nm 为主的绿色荧光。另一方面，生物体内普遍存在的胶原蛋白和弹性蛋白也会发射出>515 nm 的自发荧光，对标记物的检测造成了一定的干扰。因此，掌握不同物质的光谱信息，对清晰地观察实验动物体内标记物尤为重要。
自发荧光来源信息表
(Billinton N, Knight AW. Seeing the wood through the trees: a review of techniques for distinguishing green fluorescent protein from endogenous autofluorescence. Anal Biochem. 2001 Apr 15;291(2):175-97. )
下图为空白裸鼠解剖后在不同拍照条件下的成像结果。可以发现来自皮肤和内脏，特别是胆囊、小肠和膀胱（尿液），在蓝光的激发下发出非常强的绿色自发荧光，即使有少量的尿液从尿道渗漏（覆盖在尾部）也很容易看到。虽然使用“红色”滤光片（绿光激发）可显著降低胆囊和膀胱的自发荧光，但肠道的自发荧光仍然很高，只有在使用近红外区间才基本上消除了自荧光。
不同成像条件下自发荧光结果图
(Frangioni JV. In vivo near-infrared fluorescence imaging. Curr Opin Chem Biol. 2003 Oct;7(5):626-34.)
所以，免疫荧光标记存在一个很大的问题，即自发荧光。这将极大地降低实验图片的可用性和美观性。那么如何获取易于观察分析的清晰图片呢？
应对方法：
- 在不确定光谱信息的情况下，通过标准的荧光滤光片组，尝试多波段的成像，找出可排除自身荧光的波长；
- 选用近红外荧光染料；
- 选择带有光谱分离功能的设备，如 AniView100Pro、AniView Kirin 等。
