Neuron：北大陈雷研究组报道胞内钙离子对 TRPC3/6 通道调控的机制

丁香学术2022-10-27

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经典型瞬时受体电势通道 TRPC 是一类通透钙离子的非选择性阳离子通道¹，与最早在果蝇感光系统中发现的 TRP 通道的序列相似性最高^2,3，并且可以被第二信使 DAG 所激活。根据序列相似性以及通道的电生理特性，TRPC3/6/7 形成了一个亚类⁴。

TRPC3/6/7 通道参与多种神经活动，例如 TRPC3 在中枢神经系统高表达，参与神经生长因子 BDNF 信号转导⁵，同时 TRPC3 还与神经突触信号传递以及运动协调有关^6,7。TRPC6 通道可以促进神经元存活以及兴奋性突触的形成等^8,9。除此之外，TRPC3/6/7 通道也参与肌源性血管收缩，血压调节等过程，并且和多种疾病的发生有关，比如病理性心肌肥大，癌症发生，糖尿病等¹⁰。其中人源 TRPC6 基因功能获得性突变（GOF）会引发局灶节段性肾小球硬化症（FSGS）^11,12。因此，TRPC6 通道的抑制剂有望用于治疗该类疾病。

2007 年有低分辨率冷冻电镜研究表明 TRPC3 的胞质区可能存在一个空腔¹³，但由于分辨率所限，以及重构所得电子密度存在较多噪音，该空腔的具体结构细节并不清楚。2017 年陈雷课题组和吕伟/杜鹃课题组分别独立报道了 TRPC6 和 TRPC3 的高分辨率冷冻电镜结构^14,15，这些结构展示了该通道的整体架构，并显示在 TRPC3/6 通道中的确存在一个「胞质内空腔」。随后，Amgen 公司报道了 TRPC6 通道与抑制剂及激活剂的复合物结构¹⁶。尽管如此，该领域仍然存在着重要的科学问题尚待解决。比如，此前研究表明 Ca²⁺可以调控 TRPC3/6/7 通道的活性^17-22，但其调控机制以及 FSGS 相关突变体的致病机制仍不清楚。

2022 年 1 月 19 日，北京大学未来技术学院分子医学研究所，北大-清华生命科学联合中心陈雷研究组在 Neuron 杂志上报导了 Ca²⁺对人源 TRPC3/6 调控的结构机制以及 FSGS 相关突变体的致病机制。

在对 TRPC3/6 通道研究的过程中，作者们使用内面向外式膜片钳技术发现胞质侧 Ca²⁺可以抑制 TRPC3 通道本底电流，而对 TRPC6 通道本底电流展现出低浓度激活高浓度抑制的现象。随后他们发现 Ca²⁺可以提高纯化的 TRPC3/6 蛋白样品的热稳定性，确定了 Ca²⁺可以与 TRPC3/6 蛋白直接结合。

为了明确 Ca²⁺调控 TRPC3/6 的结构机制，作者们解析了 TRPC3/6 通道的一系列高分辨率冷冻电镜结构。通过结构比较，作者们在 TRPC3/6 中发现了 3 个 Ca²⁺结合位点（CBS1-3）。

随后的点突变、电生理和热稳定性实验证实了 CBS1 为 Ca²⁺抑制性位点，CBS3 为 Ca²⁺激活性位点。Ca²⁺在抑制性 CBS1 的结合导致 TRPC3/6 通道胞内区的结构更加紧凑，使阳离子无法从胞质内空腔中顺利流出，从而使电流减弱。进一步地，作者们使用全细胞记录模式，发现 Ca²⁺通过抑制性 CBS1 和激活性 CBS3 对 DAG 激活的 TRPC3/6 电流同样产生调节作用。

结构显示在 FSGS 疾病中发现的 TRPC6 GOF 点突变都分布于胞内区亚基间相互作用的界面上，有可能破坏了亚基间的相互作用。为了验证此假说，作者们解析了 GOF 突变体的结构，并通过电生理和热稳定性实验发现 GOF 突变体减弱了抑制性 Ca²⁺结合位点（CBS1）的作用，使胞内区结构变得松散，从而打开了阳离子从胞质内空腔向胞质区流出的孔道。

最后作者们解析了 BTDM 以及 SAR7334 与 TRPC6 结合的高分辨率结构（2.9 Å），明确了这些抑制剂与 TRPC6 结合的模式。

综上所述，本项研究通过结构解析以及功能验证，确定 TRPC3/6 通道在胞质区有一个抑制性 Ca²⁺结合位点 CBS1。当 Ca²⁺ 浓度较高时，该位点会结合 Ca²⁺，促进多个胞质区结构域之间的紧密堆积，从而抑制阳离子从 TRPC 通道胞质内空腔向细胞质的流动。当 Ca²⁺ 浓度较低时，Ca²⁺从该位点解离，使胞质区呈现较为松散的结构，从而打开了离子从胞质内空腔向胞质区流动的通路。这个抑制位点提供了 Ca²⁺对 TRPC 通道的负反馈调节。

TRPC 通道在跨膜区还具有激活型 Ca²⁺结合位点 CBS3。抑制型和激活型 Ca²⁺ 结合位点的作用相互叠加，导致了 TRPC 通道对胞内钙离子浓度复杂的响应。

而在 FSGS 患者中发现的 TRPC6 GOF 突变破坏了 TRPC6 胞质区的抑制性 CBS1 的功能，但不影响激活型 CBS3 的功能，从而使突变体通道在有 Ca²⁺流入的情况下发生正反馈而持续激活，肾脏足细胞 Ca²⁺离子过载，最终引发 FSGS 疾病的发生（图 1）。

此外，不同小分子抑制剂 BTDM 和 SAR7334 在 TRPC6 上的结合位点迥异，并且使 TRPC6 处于不同的关闭构象，从而为基于结构的药物设计提供了理论支持。