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        小鼠基因型的鉴定

        相关实验:基因型鉴定

        最新修订时间:

        丁香实验推荐阅读

        合作专家 | 张燕婷硕士

        病理生理 首都医科大学

        丁香实验推荐阅读

        审核专家 | 郭雅婕博士

        生物化学分子生物 中国科学院大学

        简介

        用小鼠鼠尾或鼠趾或组织进行小鼠基因型鉴定。

        原理

        通过化学方法裂解鼠尾或鼠趾或组织,获得小鼠基因组 DNA 并通过 PCR 方法将其扩增,通过 DNA 水平电泳结果判断小鼠基因型。

        用途

        鉴定小鼠基因型。

        材料与仪器

        试剂:

        NaOH、EDTA、Trizma base

        基因型扩增试剂盒、琼脂糖、TAE 溶液、核酸染料

         

        名称 配方 pH 值
        A 液 0.1 g NaOH + 0.058 g EDTA + 100 mL ddH2O  
        B 液  0.63 g Trizma base + 60 mL ddH2

        调节 pH = 8.0

         

        仪器:

        眼科剪、镊子、金属浴加热器、PCR 仪

        水平电泳设备(主机、电泳槽)

        步骤

        1、剪下小鼠鼠趾、鼠尾或组织适量(至少一个鼠趾或 0.5 cm 长鼠尾),放于 1.5 mL EP 管中。加入 100 μL  A 液,混匀离心,在 100 ℃ 金属浴煮 1 小时,中间取出混匀离心一次。

        2、煮完静置至室温,再加入 100 μL 的 B 液充分混匀,可立即测定基因型,也可 -20 ℃ 长期存放。

        3、取上清,依据基因扩增试剂盒说明配置扩增体系,一般每个样本中加入 10 μL Taq 酶 Mix,2 μL 上清液,1x 引物各 1 μL,最后用 ddH2O 补至 20 μL。

        注意同时制备空白对照(ddH2O 为模板)和野生型对照(野生型小鼠样本为模板)。扩增体系混匀离心后在 PCR 仪中进行扩增,扩增好的 DNA 短期 4 ℃ 存放。PCR 程序设置可根据引物设计进行调整,常规可考虑:

         

        温度 时间 循环
        94 ℃ 5 min  
        94 ℃ 30 s 35 循环
        94 ℃ 30 s 35 循环
        55 ℃ 30 s  
        72 ℃ 30 s  
        72 ℃ 7 min  
        4 ℃  

         

        4、配制琼脂糖胶,按 60 mL  1xTAE 溶液加入 0.9 g 琼脂糖的比例配制,混匀后微波炉调至中高火加热 3 分钟,确认琼脂糖粉末溶解完全后待液体稍微冷却后,加入 6 μL 核酸染料,摇晃混匀倒入制胶板中等待凝固。

        5、凝固时间约为 30 分钟,随后拔出梳子将胶放入电泳槽中,加入 TAE 溶液至漫过凝胶,每孔上样 10 μL,除了加入样本外,另外加入空白对照,野生型对照和 DNA ladder。水平电泳电压设置 120 V,时间根据条带大小确定,一般 20~30 分钟。电泳结束,在照胶仪下观测条带位置,判断小鼠基因型。

        注意事项

        1)保证清洁操作,其他物质的掺入可能导致出现杂带;

        2)ddH2O 用新灭菌后的,或者使用 DEPC 水。

        3)配置琼脂糖凝胶时,在琼脂糖完全溶解时加入核酸染料混匀后快速导入制胶板,避免冷却太长时间,避免降温出现絮状沉淀。

        另外,倒入制胶板后若出现气泡,可用干燥枪头挑破,小的气泡不影响结果。

        常见问题

        1)出现杂带:与空白对照进行比较,首先检查是否 ddH2O 的问题;其次,检查退火温度是否适合该引物的扩增,一般退火温度低于引物 Tm 值 1~2 ℃。

        2)不出现目的条带或条带很弱:与野生型对照进行比较,首先检查是否该结果即为该鼠正确基因型;其次,是否样本剪取过少或裂解不充足导致 DNA 量较少。

        来源:丁香实验

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