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        限制性内切酶法检测 TALEN 活性

        相关实验:TALEN 的活性检测

        最新修订时间:

        简介

        TALEN 质粒构建好后,在进行动物或细胞操作前,最好检测其活性,确保 TALEN 的有效性,及减少后续筛选突变体的工作量,TALEN 活性越高,后续的筛选突变体的工作量越少。常用的检测 TALEN 活性的方法有以下 3 种:luciferase SSA 法、非配对内切酶法-T7E1 法和限制性内切酶法。

        原理

        限制性内切酶法的技术原理:在 TALEN 靶点位置中间序列 Spacer 中有限制性内切酶切位点,如 Hind III。如果通过 TALEN 发生了突变,这个位点将可能被破坏,而不能被 Hind III 酶切;同时野生型的细胞不受影响,仍可被 Hind III 酶切。

        材料与仪器

        器材:


        ①凝胶电泳仪


        ②水浴锅


        ③低温离心机


        ④培养箱


        ⑤PCR 仪


        试剂:


        ①DNA 聚合酶


        ②卡那霉素;氯霉素;潮霉素


        ③培养基


        ④DNA 连接酶


        ⑤琼脂糖凝胶


        ⑥easy PGenotyping Kit 试剂盒,货号:WS009

        步骤

        限制性内切酶法检测 TALEN 活性的主要操作步骤如下:


        1)把 TALEN 质粒对共转染到相应的细胞系中,48 小时后提取基因组 DNA,然后 PCR 扩增目标 DNA 片段,或直接用细胞裂解液进行 PCR(参考唯尚立德公司的 easy PGenotyping Kit 试剂盒,货号:WS009)。


        2)PCR 产物分成两组:突变体的细胞 PCR 和 wild-type 细胞 PCR,纯化 PCR 产物,定量。


        3)用 Hind III 酶切 PCR 产物。凝胶电泳分离 DNA。判断是否有无法酶切的 DNA 产物,并计算 TALEN 造成的突变率。


        3.PCR 产物测序 PCR 实验个体的基因组 DNA,如果 PCR 产物仅有一条带,可直接送去测序,如果有杂带,回收目标带送去测序。结合测序的序列结果和测序的峰形图,判断是否发生了突变。判断标准如下:


        (1)如果读取的主峰 DNA 序列与野生型不同,可知道 TALEN 造成了突变;


        (2)如果读取的主峰的 DNA 序列与野生型相同,在 TALEN 靶点的位置附近,检查是否出现杂峰,当突变体的比例足够高,通过测序峰形图可以看出突变体形成的测序杂峰。

        来源:丁香实验

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