甲醇酵母表达系统
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1. 外源蛋白质的基因在甲醇酵母中的高效表达
目前已有多种蛋白质的基因在该表达系统中克隆成功，包括蛋白酶、酶抑制剂、受体、单链抗体等(表1)。尽管各种外源蛋白质产生的水平不一，但各种蛋白质在甲醇酵母中的产生水平均为在细菌、昆虫或哺乳动物等表达系统中产量的10～100倍［2］ 。如表皮生长因子(EGF)在酿酒酵母中的产量为7.4mg/L，而在甲醇酵母中为450mg/L，提高了60倍［3］ 。椐报道，外源蛋白质在甲醇酵母中的产量最高可达12g/L［9］ 。
表1 外源蛋白质在甲醇酵母中的高效产生
2. 实现外源蛋白质高效产生的关键因素
2.1 表达载体 首先，甲醇酵母中没有稳定的质粒，所以其表达载体采用整合型质粒。利用醇氧化酶(甲醇代谢的关键酶)基因-1(AOX 1)的启动子(PAOX1 )和转录终止子(3′AOX1 )构建成整合型表达载体。PAOX1 是一个极强的启动子，醇氧化酶的产量最高可占甲醇酵母中可溶性蛋白质的30%［2］ ，所以能使外源蛋白质在它的控制下高效产生。其次，在载体中加入酿酒酵母的分泌信号和前导肽序列(α因子)构建分泌型载体，一方面可以减轻宿主细胞的代谢负荷，另一方面可以减少宿主细胞蛋白水解酶对外源蛋白质的降解，pPIC9K、pMETαA、B、C均为此类载体。此外，使多拷贝目的基因整合入甲醇酵母染色体，形成多个表达单元，产生高产的菌株，此类载体有pAO815、pPIC3.5、pPIC9等。
2.2 受体菌 在以葡萄糖或甘油为碳源的培养基上生长时，甲醇酵母中AOX 1基因的表达受到抑制，而在以甲醇为唯一碳源时，诱导基因表达，使外源蛋白质的产量更高。甲醇酵母适合高密度连续培养的条件，细胞干重达100g/L以上，蛋白质产量极高［14］ 。受体菌采用蛋白水解酶缺陷型，从而大大降低产物的降解。常用的甲醇酵母受体菌有GS115、KM71、PMAD11、PMAD16等。
3. 应用前景
经过近几年的发展完善，甲醇酵母表达系统已日趋成熟，应用也日趋广泛。国内已有多篇在甲醇酵母中生产外源蛋白质成功的报道(表2)。美国Invitrogen公司也已开发出多种新型的甲醇酵母表达系统试剂盒，如Multi-copy Pichia Expression Kit、Easyselect Pichia Expression Kit、Pichia methanolia Expression System等，利用甲醇酵母表达系统克隆一个外源基因已十分方便。相信随着对甲醇酵母研究的进一步深入，它在生产外源蛋白质方面将日益展示出诱人的前景。
表2 国内利用甲醇酵母产生的外源蛋白质
参考文献
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