酵母蛋白表达系统（重组蛋白表达）

服务简介

　　毕赤酵母(Pichia pastoris)表达系统是近年来发展迅速、应用广泛的一种真核表达系统。它是甲醇营养型酵母菌，有两个乙醇氧化酶(Alcohol oxidase，AOX)编码基因AOX1和AOX2，两者序列相似，AOX1基因严格受甲醇诱导和调控。当甲醇为唯一碳源时，AOX1启动子可被甲醇诱导，启动乙醇氧化酶的表达，从而用甲醇进行代谢，含AOX1启动子的质粒可用来促进编码外源蛋白的目的基因的表达。

主要优势：

　　1.含有特有的强有力的AOX(醇氧化酶基因)启动子，用甲醇可严格地调控外源基因的表达

　　2.产物易分离，毕赤酵母所用发酵培养基十分廉价，一般碳源为甘油或葡萄糖及甲醇，其余为无机盐，培养基中不含蛋白，有利于下游产品分离纯化

　　3.外源蛋白基因遗传稳定，外源基因能以高拷贝数整合到毕赤酵母基因组中，不易丢失并能够得到高表达菌株

　　4.作为真核表达系统，毕赤酵母具有真核生物的亚细胞结构，具有糖基化、脂肪酰化、蛋白磷酸化等翻译后修饰加工功能

　　表达菌株特点：

　　GS115：AOX1和AOX2基因都正常表达AOX蛋白(乙醇氧化酶)，甲醇的利用效率高，接近于野生型，属于甲醇快速利用型(Mut+)

　　KM71：AOX1基因被大部分剔除，只能利用AOX2为AOX编码，甲醇利用速率变慢，表现为甲醇慢利用型(Muts)

　　外源基因的整合方式不同会导致表达菌株的表型不同：

限制酶	插入位点	GS115 表型	KM71 表型
Sa1 I/StuI	HIS4	HIS+Mut+	HIS+Muts
SacI	5’AOX1	HIS+Mut+	HIS+Muts
Bg1 II	取代AOX1	HIS+Muts	HIS+Mut

Table 1. 菌株表型

表达类型	载体名称	筛选标记	启动子
胞内表达	pAO815	HIS4	AOX1
	pPIC3K	HIS4	AOX1
	pPIC3.5K	HIS4	AOX1
分泌表达	pPICZα,A,B,C	bler	AOX1
	pPIC9K	HIS4	AOX1

　　对于胞外表达的蛋白除了可以用载体自带的信号肽，还有以下信号肽可供选择：

信号肽	蛋白序列
AlphaMF*	MRFPSIFTAVLFAASSALAAPVNTTTEDETAQIPAEAVIGYSDLEGDFDVAVLPFSNSTNNGLLFINTTIASIAAKEEGVSLEKREAEA
Dse4	MSFSSNVPQLFLLLVLLTNIVSG
Exg1	MNLYLITLLFASLCSA
Scw11	MLSTILNIFILLLFIQASLQ
SAlb	MKWVTFISLLFLFSSAYS

Table 3 . 信号肽序列

服务优势

　　1.具有完备的毕赤酵母表达平台，可以根据蛋白特性或客户需求设计不同的实验方案

　　2.具有高通量筛选平台，可以快速有效的得到最佳表达条件

　　3.具有大规模发酵生产的能力

服务内容

服务内容	客户提供	服务步骤	服务周期	交付内容
毕赤酵母表达系统	基因序列 载体 菌株	基因合成，密码子优化	2-4周	蛋白样品 技术服务报告
		亚克隆	1周
		蛋白表达测试，高通量筛选	2-3周
		发酵纯化	1-2周

案例展示

　　表达载体：pPIC3.5K(胞内表达)，目的蛋白：32.49kDa

　　表达菌株：GS115/KM71

　　诱导条件：甲醇浓度0.5%/1%，诱导时间24h/48/72h

　　结果分析：从SDS-PAGE胶图中可以看到，目的蛋白(糖基化后40kDa)有明显表达，其中GS115-5#-24h，0.5%甲醇，GS115-2#-48h，1%甲醇，GS115-3#-48h，01%甲醇，KM71-1#-72h，1%甲醇，都有很明显的目的条带，目的蛋白成功表达。