细胞冷冻和复苏

基本原理：

在长期的细胞培养过程中可能会出现微生物污染或基因型改变等情况，会导致具有优良特性细胞系的丢失。为防止这些细胞的丢失，细胞可以经快速冷冻并几乎无限期保存在非常低的温度下，如液氮（-176℃）。

试剂和设备：

• 冷冻液: 90%灭活血清 10%DMSO（或甘油），用0.45μm微孔滤膜过滤除菌，4℃保存；
• 培养液；
• 台盼蓝溶液（0.4%溶解于PBS）；
• 70%乙醇；
• 组织培养瓶；
• 15-50 ml 无菌圆锥底离心试管；
• 离心机；
• 血球计数板；
• 超净工作台；
• 光学显微镜；
• 37℃水浴；
• 冷冻管；
• -80℃冰箱；
• 液氮和液氮容器。

操作步骤：

（一）冷冻细胞

1．收集对数生长期细胞；

2．以25μl台盼蓝溶液稀释25μl细胞悬液；用血球计数板计数并计算细胞存活率（至少应该在90%以上）；

3．细胞悬液在4℃ 条件下200´g离心10分钟；

4．将沉淀的细胞重新悬浮在冷冻液中（大约5´106细胞/0.5 ml 冷冻液）；

5．将细胞悬液加入到冷冻管中，每管0.5 ml；

6．将冷冻管置于-80℃冰箱中；

7．24小时后，将冷冻管移入液氮罐中；

8．在记录本或电脑中记录下每一个冷冻管的位置以确保在以后应用时能够找到每一个冷冻管。

（二）细胞复苏

1．将冷冻管迅速由液氮转入到37℃水浴中，冷冻管的顶部保持在水面以上以避免任何污染，不定时搅拌加速解冻；

2．当细胞完全解冻后，用含70%乙醇的纱布擦拭冷冻管消毒；

3．将解冻后细胞转移到含4℃预平衡培养液的试管中；

4．细胞悬液在4℃下200´g离心10分钟；

5．弃上清，将细胞重新悬浮在新鲜培养液中；

6．将细胞转移到细胞培养瓶，CO2孵箱中培养；

7．是用倒置显微镜检查细胞存活率以及细胞密度，如果细胞密度过高，用培养液稀释至适宜浓度。

对照试验

在冷冻细胞被移入到液氮罐中一段时间后，取出一管细胞复苏并进行培养以检测存活率。

实验要点及说明：

1．严格遵守液氮操作规则（即戴上合适的手套和护目镜），液态氮对眼睛极为有害；

2．对一瓶细胞培养液要尽可能多分装几个冷冻管；

3．延长暴露在DMSO中的时间对细胞有害，因此冷冻和解冻操作要尽可能快；

4．细胞可以暂时稳定保存在-80 ℃达数月；

5．每批次冷冻和复苏的细胞的存活率可能会不相同，为避免这个问题，每次细胞冻存最好分两批以上进行；

6．DMSO可以防止在细胞内部出现冰结晶，冻存过程需要逐步降低温度；

7．如果复苏后细胞难以恢复到良好状态，可以使用含10%鼠胚胎成纤维母细胞培养上清的培养液以促进恢复；

8．也可以用含20%热灭活胎牛血清和10%DMSO的培养液为冷冻液。