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        ​荧光素标记抗体

        相关实验:病毒免疫荧光实验

        最新修订时间:

        材料与仪器

        实验材料
        试剂、试剂盒

        步骤

        荧光标记抗体方法有直接标记法和间接标记法两种。


        (1) 直接法:较为常用,具体步骤是:


        1) 抗体溶液的制备:用 0.01mol/L pH 7.1 PBS 将待标记抗体稀释至 20mg/ml;


        2) 荧光素:根据待标记抗体的总量,按 0.01mg 荧光素/mg 蛋白,将荧光素溶解于 0.5mol/L pH 9.5 碳酸盐溶液中,体积为抗体溶液的 1/10;


        3) 标记:于4℃条件下,抗体溶液放置在磁力搅拌机上,将荧光素逐滴缓慢加入,同时保持反应液pH 值在8.5左右,如此连续搅拌反应 4~6h。应尽量避免产生泡沫,避免将荧光素粘在容器壁及搅拌棒上;


        4) 透析:标记后的抗体溶液 2500r/min 离心 20min, 取上清在 10~50 倍体积的 pH 8.0 PBS中透析2~4h;


        5) 标记抗体的纯化: Sephadex G-50 凝胶过滤去除游离荧光素。本法标记均匀,重复性好,极少产生非特异性荧光,蛋白质也少变性,荧光亮度好,保存时间长。


        (2) 间接法:


        1) 抗体溶液的制备:用 0.025mol/L pH 9.5 PBS将待标记抗体稀释至10mg/ml, 装入透析袋中;


        2) 荧光素溶液的配制:根据待标记抗体的总量,按 0.05mg 荧光素/mg蛋白称取荧光素,溶解于0.025mol/L pH 9.5 碳酸盐溶液中,体积是抗体溶液的 10 倍;


        3) 标记:将透析袋浸泡于荧光素溶液中, 4℃磁力搅拌 16~18h;


        4) 标记抗体的纯化: Sephadex G-50 凝胶过滤去除游离荧光素。

        来源:丁香实验

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