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        技术和方案28 系统缺失菌株的保存及操作

        相关实验：酵母遗传学方法实验

        最新修订时间：

        材料与仪器

        步骤

        出芽酵母的遗传及基因组分析在过去的几年中取得了令人瞩目的成绩，产生了供公 共使用的多个改进酵母菌株集，可用于多种研究。对这些可利用的缺失突变集，其基因 组中的几乎每个基因，都通过一步基因置换法代入一 模块产生了缺失突变。 为方便起见，将 模 块 插 入 数 个 20b p 独特寡核苷酸序列间，序列作为独特标 识 ，称 为 “条形码” 。只要利用一系列可扩增^独特条形码（ 上游标签）及 3'独特条形 码 （ 下游标签）的引物，这些独特的条形码就可被分别扩增出。关于此缺失集构建的描 述 ，可 在 酵 母 缺 失 联 盟 网 网 页 中 找 到 （ h ttp : //www-sequence.Stanford,edu/group/ yeast_ deletion_ project/deletions3. htm l)。在其他大的酵母菌株集中，每一可读框都 被标识上谷胱甘肽转移酶（ GST)、 绿色荧光蛋白（ GFP) 或连续亲和纯化（ TAP) 表 位。这些菌株可单个或一起购买，其商业卖主有Open Biosystems和 American Type Culture Collection (ATCC)。 缺失集具有相同的基因背景，同基因突变在BY4741 (M ATa)， BY4742 (M ATa) 及 BY4743 (M ATa/MATa) 中均可获得。非必需基因的缺失突变型可在单倍体及杂合 二倍体中得到，如果预购买单一菌株，最好购买二倍体。必需基因的缺失突变型只可在 杂合二倍体中取得。若待研究的是非必需基因缺失突变型，则必须分析四分体以获得需 要的单倍体基因型，包括同基因的BY4741或 BY4742。菌株一旦获得，需立即冻存以 便将来使用。缺失突变型常不利于生长，并且延长单倍体突变型的传代时间会产生回复 突变，突变型通常为非整倍体。缺失突变型适合度的下降常常是隐性的，因此使用二倍 体可将基因型改变的问题最小化，在减数分裂后复苏单倍体可减少单倍体传代的总时 间。另外，我们推荐研究者测试任一突变型表型以确认分离到的突变型是正确的，因 G418抗性检测并不充分（ 因所有的缺失突变都以此为标记）。我 们 建 议 使 用O o i等 (2001)的提供的策略，即通过扩增条形码进行检测，扩 增 的 “上游标签”及 “下游标 签”D N A 片段可被克隆及测序，条形码序列在O o i等 （2001)的 “补充材料”中可找 到。此操作可确定研究者使用了正确的突变型。 有时需要购买完整菌株集。例如， 系统遗传 分 析 （ SGA) 就需要整个缺失集。从 ATCC 邮购的菌株集分装于74块密封的96孔板中，并 以 150M 甘油冷冻保存。在从平 板复苏菌株的过程中，最主要的问题是交叉污染，因此要格外小心避免此情况发生。平 板于室温解冻，离 心 lm in 以除去封条上的液体，小心撕去封条，用 无 菌 针 （ 实验六， 合成致死突变体）从原始板中转移菌株。以新封条（ 如辐射灭菌Nalgene Nimc 96孔封 条 ，目录# 236366)将平板小心重新封好，用为微量滴定板设计的保存架，冻于 一 70°C ， 建立一数据库以指示平板保存的位置。这些菌株可以每板384个克隆的格式接 种到含YPD+ G418的一孔板上，如实验六中所示设4 个指示孔：第一块平板使用孔 A ， 第二块平板使用孔B，以此类推。接种后的平板于30°C下培养2 天。 克隆阵列应转 接人含50^1丫?0+200啤/11110418的384孔微量滴定板中， 30°C 生长两天后，加入
        25pl 4 5 % 的甘油，封好平板，使用为微量滴定板设计的保存架冻于一70°C ， 建立一数 据库以指示平板保存的位置。在许可情况下， 建议保存两套集在不同冰箱中，这样集合 的完整性就可有两个内部核对方式。 第一个是看原始的9 6 孔微量滴定板，其中，某些 孔无酵母菌株，可极好地指示交叉污染的程度。如果在本应空着的孔中无菌生长，则交 叉污染最少。 第二个是检测几大类突变型的表型。将 384平板上的菌分别接入含固体 YPD，YPG 及 SD的一孔板中，小菌落突变型不能在YPG 上生长，营养缺陷型不能在 SD上生长，如果所有适当表型的菌株都复苏了，则交叉污染最少。

        来源：丁香实验

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