原位杂交操作流程

1、使用地高辛标记的核酸探针进行石蜡切片的 RNA 原位杂交第一天
1 ） 二甲苯于 37 ℃脱蜡 2 次，每次 15 分钟；
2 ） 无水乙醇浸泡 2 次，每次 3 分钟；
3 ） 95% 乙醇浸泡 2 次，每次 3 分钟；
4 ） PBS 清洗 3 分钟；
5 ） 2% 焦碳酸二乙酯室温下浸泡 10 分钟；
6 ） PBS 清洗 10 分钟；
7 ） 加入胃蛋白酶 25ul/ml ， 37 ℃孵育 15 分钟；
8 ） PBS 清洗 2 次，每次 3 分钟；
9 ） 0.2N 的 HCl 孵育 30 分钟；
10 ） PBS 清洗 2 次，每次 3 分钟；
11 ） 0.25% 无水乙酸和 0.1M 三乙醇胺孵育 10 分钟；
12 ） PBS 清洗 2 次，每次 5 分钟；
13 ）预杂交缓冲液孵育 30 分钟；
14 ）准备核酸探针混合物：使用预杂交缓冲液稀释探针， 85 ℃加热 5 分钟，置于冰块中 10 分钟；
15 ）杂交； 第二天
16 ）将玻片置于 SSC 中 2 次，每次 5 分钟以去除封片；
17 ） PBS 清洗 3 分钟；
18 ） RNA 酶 A 溶液中（或 0.1-1ng/mlPBS 中）， 37 ℃孵育 30 分钟；
19 ） PBS 清洗 5 分钟；
20 ）室温， 2×SSC 清洗 10 分钟；
21 ） 37 ℃， 1×SSC 清洗 10 分钟；
22 ） 37 ℃， 0.5×SSC 清洗 10 分钟；
23 ）缓冲液 A 孵育 10 分钟；
24 ）缓冲液 A （ 1% 正常绵羊血清和 0.03% 三重氢核 X-100 ）孵育 30 分钟；
25 ）加入抗地高辛抗体（ 1/200 的上述缓冲液，来自 Boehringer Mannheim ）， 37 ℃孵育 3 小时；
26 ）缓冲液 A 清洗 2 次，每次 10 分钟；
27 ）缓冲液 B 清洗 2 次，每次 5 分钟；
28 ）制成 NBT/BCIP 暗处保存 30-60 分钟，显微镜下进行观察，如果背景尚佳，显色时间可延长到 16 小时；
29 ）停止缓冲液 B 的反应，用水进行简单的清洗；
30 ）固红，脱水以及封片进行核的复染。
2 、使用地高辛标记的寡核苷酸探针进行石蜡切片的原位 DNA 杂交 第一天
1 ） 二甲苯于 37 ℃脱蜡 2 次，每次 15 分钟；
2 ） 无水乙醇浸泡 2 次，每次 5 分钟；
3 ） 95% 乙醇浸泡 2 次，每次 5 分钟；
4 ） PBS 清洗 5 分钟；
5 ） 2% 焦碳酸二乙酯室温下浸泡 10 分钟；
6 ） PBS 清洗 5 分钟；
7 ） 加入胃蛋白酶 25ul/ml ， 37 ℃孵育 10 分钟；
8 ） PBS 清洗 2 次，每次 5 分钟；
9 ） 0.2N 的 HCl 孵育 30 分钟；
10 ） PBS 清洗 2 次，每次 5 分钟；
11 ） 0.25% 无水乙酸和 0.1M 三乙醇胺孵育 10 分钟；
12 ） PBS 清洗 5 分钟；
13 ）预杂交缓冲液孵育 30 分钟；
14 ）准备寡核苷酸探针混合物：使用预杂交缓冲液稀释探针；
15 ）杂交； 第二天
16 ）将玻片置于 SSC 中以去除封片；
17 ）室温， 2×SSC 清洗 10 分钟；
18 ） 37 ℃， 1×SSC 清洗 10 分钟；
19 ） 37 ℃， 0.5×SSC 清洗 10 分钟；
20 ）缓冲液 A 孵育 10 分钟；
21 ）缓冲液 A 孵育 30 分钟；
22 ）加入抗地高辛抗体 37 ℃孵育 3 小时；
23 ）缓冲液 A 清洗 2 次，每次 5 分钟；
24 ）缓冲液 B 清洗 2 次，每次 5 分钟；
25 ）制成 NBT/BCIP 暗处保存 30-60 分钟，显微镜下进行观察，如果背景尚佳，显色时间可长到 16 小时；
26 ）停止缓冲液 B 的反应，用水进行简单的清洗；
27 ）固红，脱水以及封片进行核的复染。