cDNA文库组标准流程二:mRNA的分离

 

1.Oligotex mRNA Kits  (QIAGEN ）法

 准备工作：

1.将Oligotex Suspension 置于37℃水浴中，旋转混匀，溶解Oligotex.,然后置于室温。

2.将OBB Buffer置于37℃水浴中，旋转混匀，重溶沉淀物，然后置于室温。

3.将OEB Buffer 置于70℃水浴中，待用。

 

试验步骤：

 

表3：加入试剂量据此表

Total RNA	RNase-free Water to:	Buffer OBB (ul)	Oligotex Suspension  (ul)	Prep size
<=0.25mg	250ul	250ul	15	Mini
0.25-0.5mg	500ul	500ul	30	Midi
0.5-0.75mg	500ul	500ul	45	Midi
0.75-1.00mg	500ul	500ul	55	Midi

 

1.      Total RNA 量不要多于1mg，用移液器取出所需RNA量到1.5ml离心管中，加RNase-free water 补足到500ul

2.      根据表3加入适当体积的OBB Buffer和Oligotex Suspension， 轻弹1.5ml离心管彻底混匀

3.      置于70℃水浴中3min

4.      取出置于室温（20℃－30℃）10min

5.      13000rpm室温离心 2min，用移液器吸出上清到一个新的1.5ml离心管中，保留上清直到polyA被结合上。

6.      用移液器取400ul OW2 Buffer混匀沉淀物，将混合物转移到 Spin Column中，RT ，13000rpm，离心1min

7.      将Spin Column 转移到一个新的1.5ml离心管中，加400ul OW2，RT，  13000rpm，离心1min

8.      将Spin Column 转移到一个新的1.5ml管中，取出25ulOER Buffer(70℃)到Column中，用移液器吹打3－4次树脂，室温 13000rpm，离心1min。

9.      取出25ul OER Buffer(70℃)到Column中，用移液器吹打3－4次树脂，室温 13000rpm，离心1min。

10.  测OD,并电泳定量。

2. 磁珠法分离 mRNA

1. 在RNase-free的Eppendorf 管中加入0.1~1.0mg的总RNA和RNase-free水至终体积为500ul.

2.  65ºC加热10分钟。

3. 加入3ul生物素标记的Oligo(dT)和13ul 20×SSC于RNA中，轻轻混合，室温放置逐渐冷去至室温，一般需10 分钟左右。

4. 同时配0.5×SSC 1.2ml和0.1×SSC 1.4ml.

5. 将磁珠（SA-PMPs）轻晃散开，放入磁性分离架上，使SA-PMPs集中于管的一侧（约30sec），小心去上清，切不可离心。用0.3ml 0.5×ssc漂洗SA-PMPs,用磁性分离架集中磁珠，去除上清，重复3次。

6. 将漂洗后的SA-PMPs重新悬浮于0.1ml 0.5Xssc,注意漂洗后的SA-PMPs应在30分钟内使用。

7. 将（3）中的oligo(dT)/mRNA退火反应物全部加入含漂洗好的SA―PMPs管中，轻轻摇匀，室温下放10 分钟。

8. 用磁性分离架捕获SA-PMPs,小心去上清，但不要弃去。

9.    用0.1×SSC,每次0.3ml洗3次，每次都晃至SA-PMPs悬浮，最后一次漂洗后尽可能多的吸取水相，而不损坏SA-PMPs.

10.将SA-PMPs重新悬浮在0.1ml RNase-free水中，反复颠倒，使SA-PMPs散开，洗脱mRNA。

11.用磁性分离架捕获SA-PMPs,将洗脱的mRNA吸入另一个新的Eppendorf管中。

12.将SA-PMPs再悬浮于0.15ml RNase-free的水中，洗脱，与（11）步洗脱液合并。

13.将得到的mRNA溶液取几微升跑电泳，若mRNA浓度不足以进行下一步的反转录，则需将得到的mRNA溶液浓缩（浓缩步骤见14-18）。

14.加0.1体积的3mol/l NaAc和1.0体积的异丙醇于洗脱液中，-20ºC沉淀过夜。

15.4ºC，13000g离心60 分钟。去上清，加入500ul 70%乙醇混匀。

16.4ºC，7500g离心10 分钟。

17.去上清，真空或空气中自然风干，但不要太干，加适量RNase-free水溶解。

18.重复步骤5-12，将步骤8保留下的样品重新上柱

注意事项：

1．所有操作均需要严格戴手套，戴口罩进行

2．如果total RNA质量高，杂质少，就选择Oligotex的方法分离mRNA，相反则可以用磁珠法。

3．mRNA的电泳图是smear。