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        DNA的提取和纯化

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        1 DNA提取
        ⑴ 新鲜外周静脉血3~5ml,以ACD(柠檬酸纳缓冲液)1/7体积抗凝;
        ⑵ 3500rpm 15分钟离心,吸除上层血浆;
        ⑶ 加5倍体积蒸馏水(灭菌),摇匀,静置5~10分钟,3500rpm15分钟离心,去上清,(若沉淀不够,可重复1~2次);
        ⑷ 吸取沉淀(少许液体)放入1.5ml离心管,STE 清洗2次;12000rpm 7~8分钟离心;
        ⑸ 去上清后加0.5mlSTE,10%SDS 25~30ml,蛋白酶-K 5μl(100μg/ml)37℃消化过夜,直至沉淀物溶解为止;
        ⑹ 等体积饱和酚,倒转摇匀10分钟。12000rpm 5分钟,离心,吸上层入另一1.5ml离心管;勿吸入蛋白层;
        ⑺ 上清液加等体积酚:氯仿:异戊醇(25:24:10),倒转混匀10分钟。12000rpm 5分钟,离心,吸上层入另一1.5ml离心管;
        ⑻ 上清液加等体积氯仿:异戊醇(24:1),倒转混匀10分钟,12000rpm5分钟,取上清入另一管;
        ⑼ 加1/12体积3M 醋酸钠,混匀后再加3倍体积的4℃无水乙醇,轻柔振摇;应出现白色絮状物(DNA);于-20℃放置20~30分钟,12000rpm 低温(4℃)离心10分钟,沉淀DNA,去上清;
        ⑽ 加1ml 70%乙醇洗涤,12000rpm 低温(4℃)离心10分钟,去上清,重复1次;
        ⑾ 自然干燥后,用pH8.0TE溶解,保存在-20℃备用。

        2 DNA浓度的测定取15ul DNA  标本加1485μl 双蒸水,充分混匀后,用紫外分光光度计测定波长分别为260nm、280nm、330nm时的OD值,计为OD260、OD280、OD330,计算浓度和比值,判断DNA的浓度和纯度。
        DNA浓度(μg/ml)=(OD260-OD330)×50μg/ml×稀释倍数(100)
        DNA纯度=(OD260-OD330)/(OD280-OD330)
        若DAN纯度<1.6, 表明有残存酚或蛋白含量太高,用氯仿抽提纯化。

        3 DNA的纯化
        ⑴ 加等体积氯仿;异戊醇,轻轻振摇5分钟,12000rpm低温离心5分钟,吸取上层水相至另一EP管;重复一次;
        ⑵ 加入1/12体积的3M NaAC,混匀,再加入2.5倍体积无水乙醇沉淀DNA;12000rpm低温离心5分钟,去除上清;
        ⑶ 加1ml 70%乙醇洗涤,12000rpm 低温离心10分钟,去上清;重复1次;
        ⑷ 真空干燥,加适量TE溶解,置4℃备用。

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